H5N1/H7N8/H10N4禽流感病毒的分子特征及致病性研究

论文摘要

本研究主要对2006年春季在青海湖地区开展的候鸟禽流感病毒流行病学调查的样品，运用夹心ELISA方法筛选AIV抗原阳性样品，以鸡胚增殖培养分离禽流感病毒，从患病濒死的斑头雁、大天鹅和红嘴鸥内脏中分离得到的3株高致病性H5N1禽流感病毒：A／Bar-headed Goose／Qinghai／F／2006（H5N1）、Whooper swan／Qinghai/01／2006（H5N1）和A／Black-headed gull／Qinghai／3／2006（H5N1）。通过对3株病毒的全基因组序列分析与进化研究，其分子特征分析结果显示：Whooper swan／Qinghai／01／2006株和Bar-headed Goose／Qinghai／F／2006株的PB1基因的核苷酸序列同源性为94％之外，3株病毒其余基因片段的核苷酸序列同源性为99％。以A／Black-headed gull／Qinghai/3／2006为代表与2005年青海湖、西伯利亚候鸟AIV毒株核苷酸序列相比同源性为99％。3株病毒HA蛋白的氨基酸裂解位点序列均为-RRRKKR-，是高致病性禽流感病毒的显著特征。PB2蛋白的第627位为赖氨酸，提示3株分离株具有感染哺乳动物的能力。NA蛋白的茎杆区第49～68位有20个氨基酸的缺失，在M2蛋白穿膜区的Leu26，Val27，Ala30，Ser31等位点都没有出现突变，提示对金刚烷胺类药物与神经氨酸酶抑制类药物未产生抗药性。为进一步揭示3株病毒在候鸟中亚国际迁徙路线上与沿途地区H5N1禽流感病毒的传播关系，选择了迁徙路线上候鸟、家禽和人禽流感H5N1病毒的基因序列共同构建系统进化树分析，结果显示，该3株病毒与2005年青海和西伯利亚的H5N1毒株集聚在一个分支，在亲缘关系上最为接近。3株病毒分别感染雏鸡和小鼠进行致病性实验，结果符合OIE高致病性H5N1的诊断标准，证明3株病毒都为高致病性禽流感病毒，对禽类和哺乳类动物都具有高致病性。其次，采用基因克隆等分子生物学方法，完成了2株1983年鸭源禽流感病毒的亚型鉴定、序列测定、进化分析及致病性研究。将2株病毒的HA、NA、M、NS、PA、PB1和PB2基因经过RT-PCR扩增，连接到pMD19-T载体，筛选阳性克隆子，酶切鉴定、测序分析。分别鉴定为A／DK／Hubei／137／83（H10N4）和A／DK／Hubei/216／83（H7N8）。前者HA氨基酸剪切位点序列为P-E-V-V-Q-G-R，后者HA剪切位点序列为P-E-I-P-K-R；2株病毒的NA在第48位氨基酸后无20个氨基酸的缺失；NS蛋白的第79～84位也没有氨基酸的缺失，不具有高致病性特征；A／DK／Hubei／216／83（H7N8）与香港1972～1997年不同亚型AIV的同源性为96％～98％，进化分析表明，除NA和PB2独自成一支外，其余5个基因都与1972～1997年毒株亲缘关系较近。A／DK／Hubei／137／83（H10N4）除NA和M基因外，其他5个基因分别独立自成一支。序列相似性分析结果显示，NS、PA、PB1、PB2基因与1997～2004年H5N1 AIV同源性为98％～99％。2株病毒动物感染试验结果显示均为低致病性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1. 病原学
• 2. 流行病学
• 3. 基因组结构及编码蛋白
• 4. 毒力变异及其分子机制
• 5. 基因工程疫苗的研制
• 6. 选题的目的意义
• 第2章 2006年青海候鸟H5N1禽流感病毒的分子特征研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果与分析
• 3. 讨论
• 第3章 两株鸭源禽流感病毒的基因克隆、序列分析及致病性研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果与分析
• 3. 讨论
• 第4章 结论
• 1. 2006年青海候鸟 H5N1 禽流感病毒的分子特征及致病性研究
• 2. 两株鸭源禽流感病毒的基因克隆、序列分析及致病性研究
• 参考文献
• 已公开发表的论文
• 发明专利
• 专著
• 致谢