番茄乙烯信号转导组分EIN3互作蛋白LeEBFs的基因克隆和功能研究

论文摘要

乙烯作为植物激素,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。乙烯对植物生长发育过程的影响包括:种子萌发、对茎和根伸长的抑制、开花、衰老和脱落、性别分化、果实成熟、胁迫反应等。目前,乙烯信号转导途径及其调控机理已成为植物分子生物学的研究热点。Potuschak和Guo等同时在拟南芥中发现了两个能与EIN3相互作用的F结构域蛋白,EBF1和EBF2蛋白（EIN3-binding F- box protein）。EBF1的过量表达使植物对乙烯不敏感。相反,带有EBF1和EBF2双突变体的efb1/efb2植株在没有乙烯的情况下却能产生乙烯组成性的反应,并有EIN3蛋白的积累,表明乙烯反应依赖于EIN3蛋白的稳定性。乙烯可以快速提高拟南芥EIN3蛋白水平,在没有乙烯存在的情况下,EIN3蛋白可以迅速通过EBF1和EBF2所介导的ubiquitin/proteasome途径而降解。这表明ubiquitin/proteasome途径通过降解EIN3蛋白而淬灭乙烯信号,从而表现出对乙烯信号的负调节,所以对EIN3蛋白的调控是乙烯信号转导途径的关键步骤。对番茄LeEBF1和LeEBF2基因的研究,将使我们对番茄乙烯信号转导、果实成熟及环境胁迫中防卫反应相关基因调控的机理更加明确,为利用基因工程技术改良番茄等作物提供理论依据。本研究主要取得了以下结果:①通过RACE和RT-PCR方法从番茄中克隆得到LeEBF1和LeEBF2的全长cDNA序列,其长度分别是2866和2891 bp。序列分析表明,它们的开放阅读框分别是1911和1995bp,分别编码637和665个氨基酸残基,在氨基端含保守的F-box区域,在羧基端有14个亮氨酸重复单位。通过BLAST软件和DNAMAN分析表明这两个基因的氨基酸序列同源性高达58.6%,同时与其他物种EBF蛋白的F-box区域同源性达24.4%-73.2%。由此我们推论LeEBF1和LeEBF2可能属于EBF蛋白家族。②Northern杂交结果表明:LeEBF1与LeEBF2在野生型和Nr的幼叶中的表达量均高于成熟叶;在果实发育过程中,LeEBF1与LeEBF2在青果期的表达量相比其他时期要弱。③根据siRNA序列设计要求,构建了LeEBF1与LeEBF2基因的RNAi载体,并转化到了Nr番茄中,得到了10棵转化苗,为进一步研究LeEBF1与LeEBF2基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 乙烯信号转导研究进展
• 1.2 泛素降解途径
• 1.3 乙烯与番茄
• 1.4 全长基因克隆策略
• 1.4.1 文库筛选法
• 1.4.2 PCR 技术扩增基因全长
• 1.4.3 电子克隆（Silico cloning）
• 1.5 RNA 干扰研究进展
• 1.5.1 RNAi 作用机制
• 1.5.2 RNAi 的应用
• 1.6 课题的提出和研究意义
• 1.7 研究内容和技术路线
• 1.7.1 主要研究内容
• 1.7.2 技术路线
• 1.7.3 本课题的特色与创新之处
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试材料、质粒、菌株、试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 RT- PCR 和3’RACE 方法克隆LeEBF1 和LeEBF2 的全长cDNA
• 2.2.2 生物信息学分析
• 2.2.3 Northern 分析
• 2.2.4 载体构建
• 2.2.5 番茄转化
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄LEEBF1 和LEEBF2 基因的全长CDNA 序列的扩增
• 3.2 LEEBF1 和 LEEBF2 基因的序列分析
• 3.3 LEEBF1 和 LEEBF2 基因的表达分析
• 3.4 LEEBF1 和 LEEBF2 基因的沉默载体的构建
• 3.5 番茄的遗传转化
• 3.5.1 番茄LeEBF1 和LeEBF2 沉默载体转化农杆菌LBA4404
• 3.5.2 农杆菌介导番茄转化
• 4 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• B. 作者在攻读学位期间参加的课题