木豆毛状根培养体系的建立及相关生理生化研究

论文摘要

由发根农杆菌诱导出来的毛状根具有快速生长,多分枝,无向地性以及遗传性能相对稳定的优点,其新陈代谢能力非常活跃,而且具有与原植物相似的次生代谢途径。因此,毛状根不仅能够合成与原植物相同的化合物,而且可能积累这些化合物的中间产物和衍生物,含量与原植株相当甚至高于原植株含量,甚至会产生新的化合物。在药用植物研究领域,利用发根农杆菌诱导和培养毛状根的方式提取药物的有效成分,已成为一个研究的热点。本文以发根农杆菌LBA9402和木豆叶片为材料,经过预培养、浸染、共培养、除菌等步骤,最后扩大培养得到木豆毛状根的培养体系。以此为基础,测定木豆毛状根悬浮培养的生长动态、保护酶（CAT、 POD、SOD）活性、可溶性蛋白含量的变化的趋势以及次生代谢物芹菜素、染料木素合成的动态变化。探讨了紫外照射、钙离子、IBA三种诱导因素对木豆毛状根生理生化指标的影响,为提高木豆毛状根悬浮培养生长率及其中次生代谢物含量提供依据。主要研究结果如下：1.木豆毛状根培养体系的建立利用发根农杆菌LBA9402浸染木豆叶片得到木豆毛状根,从实验中得到诱导木豆毛状根的最佳条件是：预培养2-4天,在浓度为OD600=0.6-0.8的菌液中浸染20min,吸干叶片表面菌液,转入无激素培养基中共培养3天,得到木豆叶片毛状根的转化率为60.00%,乙酰丁香酮能够促进发根农杆菌的转化,提高木豆叶片毛状根的诱导率。经PCR检测,得到特异性条带,说明发根农杆菌的T-DNA成功整合进毛状根的基因组中。实验还证明,N6液体培养基、30g/L的蔗糖以及外源激素IBA都可以促进木豆毛状根的生长。2.木豆毛状根生长周期中生理生化指标的研究木豆毛状根的生长率与培养基中蔗糖含量存在良好的线性关系,成反比；其生长经历了延迟期、快速生长期以及生长平缓期；三种保护酶的活性总体来说是先上升后下降的趋势,而可溶性蛋白的含量则呈一直增加；芹菜素与染料木素的含量都随着时间的延长不断增加,到生长周期趋于平缓,木豆毛状根的生长代谢周期为20天。3.影响因素对木豆毛状根生理生化指标的影响紫外照射20min、1mmol/L钙离子浓度以及0.5mg/L的IBA浓度促进木豆毛状根生长的效果最显著。当IBA浓度是0.5mg/L时,保护酶活性达到最大,最有利于芹菜素和染料木素的积累。紫外照射会抑制POD和SOD的活性,钙离子处理下的POD和SOD酶活性的变化趋势与其生长率的变化趋势相一致,而CAT酶的变化则缺少规律性。可溶性蛋白含量变化不显著。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 绪论
• 1.1 我国药用植物资源现状和发展状况
• 1.1.1 我国药用植物资源的地位
• 1.1.2 我国药用植物资源的现状
• 1.1.3 我国药用植物资源的保护
• 1.2 木豆概况
• 1.2.1 木豆的起源与分布
• 1.2.2 木豆的形态特征
• 1.3 木豆的研究与应用
• 1.3.1 木豆化学成分的研究
• 1.3.2 木豆药用和药理的研究
• 1.4 发根农杆菌
• 1.5 毛状根
• 1.5.1 毛状根的研究进展
• 1.5.2 毛状根的诱导
• 1.5.3 毛状根的特点与鉴定
• 1.5.4 毛状根中次生代谢产物
• 1.5.5 不同因素对毛状根次生代谢产物形成的影响
• 1.6 本研究目的与意义
• 2 木豆毛状根培养体系的建立
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 细菌菌株
• 2.2.3 实验制剂与设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 细菌菌株与活化
• 2.3.2 无菌苗的获得
• 2.3.3 外植体转化
• 2.3.4 毛状根的除菌
• 2.3.5 毛状根的统计
• 2.3.6 毛状根PCR检测
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 木豆无菌苗的获得
• 2.4.2 木豆毛状根的形成及观察
• 2.4.3 各种影响因子对木豆毛状根转化率的影响
• 2.4.4 木豆毛状根PCR检测
• 2.4.5 影响因子对木豆毛状根生长的影响
• 2.5 结论
• 3 木豆毛状根培养周期的生长特性及生理生化指标的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 木豆毛状根的悬浮培养
• 3.2.2 毛状根鲜重测定方法
• 3.2.3 保护酶活性的测定方法
• 3.2.4 可溶性蛋白含量的测定方法
• 3.2.5 可溶性糖含量的测定方法
• 3.2.6 木豆毛状根中染料木素与芹菜素的测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 木豆毛状根培养周期的生长曲线
• 3.3.2 木豆毛状根培养周期中3种保护酶活性的变化
• 3.3.3 木豆毛状根培养周期中可溶性蛋白含量的变化
• 3.3.4 木豆毛状根培养周期中碳源的消耗
• 3.3.5 木豆毛状根培养周期中染料木素与芹菜素的积累
• 3.4 结论
• 4 不同因子对木豆毛状根生理生化指标及次生代谢产物积累的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 木豆毛状根的悬浮培养
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 紫外照射对木豆毛状根生理生化指标的影响
• 4.3.2 钙离子对木豆毛状根生理生化指标的影响
• 4.3.3 IBA浓度对木豆毛状根生理生化指标的影响
• 4.3.4 植物激素对染料木素和芹菜素积累的影响
• 4.4 结论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢