论文摘要
作为天然高分子材料之一的多糖具有良好的生物相容性和安全性,疏水改性多糖通过自组装方式形成具有独特的“核壳结构”的纳米粒,在体内具有长循环、主体稳定性和被动靶向性等特点,在药物传输领域有着潜在的应用前景。了解纳米粒与细胞的相互作用对于在细胞层次上理解生命体的生理过程、药物的作用机制、基因治疗的机理等具有重要的科学意义和实用价值,同时也可为构建更加安全有效的纳米药物载体提供依据。本研究采用异硫氰酸荧光素（FITC, fluorescein isothiocyanate）标记胆固醇基普鲁兰（CHSP, cholesterol-modified pullulan）并制备纳米粒,讨论了纳米粒浓度、孵育时间以及温度对细胞摄取的影响,研究了CHSP纳米粒的体外HepG2细胞的摄取机制以及亚细胞分布。同时,评价了CHSP纳米粒作为阿霉素（DOX, doxorubin）药物载体的细胞毒性,研究了HepG2细胞对载药纳米粒的摄取以及对药物的亚细胞分布进行定位和定量分析,为肝癌治疗提供了研究基础和理论依据。主要研究内容及结果如下：1. FITC标记的CHSP （FITC-CHSP）合成及自组装纳米粒的制备和表征合成了FITC-CHSP并通过红外进行表征,结果表明,FITC实现了接枝成功。采用透析法制备了FITC-CHSP自组装纳米粒,并利用透射电镜（TEM）和动态光散射粒度分析仪（DLS）对纳米粒的形态、粒径及粒径分布进行了表征,研究结果表明,制备的FITC-CHSP纳米粒呈规则的球形,平均粒径为63.0±1.9nm。2. FITC-CHSP自组装纳米粒的体外HepG2细胞摄取机制以及亚细胞分布CHSP纳米粒的体外细胞毒实验表明：CHSP纳米粒对HepG2细胞无明显的细胞毒性。分别采用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）和荧光光度法对HepG2细胞摄取CHSP纳米粒进行观察和定量,系统研究了纳米粒浓度、孵育时间、孵育温度对纳米粒摄取的影响。结果表明,HepG2细胞摄取纳米粒的过程是能量依赖的过程,呈现出浓度依赖性、时间依赖性和温度依赖性。内吞抑制实验表明：网格蛋白介导的内吞途径以及巨胞饮途径共同参与了CHSP纳米粒的入胞过程。纳米粒的亚细胞分布实验表明：在研究的孵育时间（4h）内,并没有发现CHSP纳米粒进入高尔基体和内质网。当纳米粒与细胞孵育30min时,没有纳米粒定位于溶酶体中。但是,随着孵育时间的延长,大量纳米粒分布于溶酶体中,且定位于溶酶体中的纳米粒逐渐向细胞核周区域移动。3.载阿霉素CHSP纳米粒的制备及体外药物释放以DOX为模型药物,采用透析法制备了载DOX的CHSP纳米粒,并用TEM和DLS对载药纳米粒进行表征,结果证实,载药纳米粒呈球形,随着药物与载体投料比的增加,纳米粒的粒径也增大（185.6-226.4nm）。采用紫外-可见分光光度法测得载药纳米粒的载药量在10.31-30.79%范围内,可通过调整起始药物投料比对载药量调控,包封率为71.2-88.3%。载药纳米粒的体外释放与释放介质的pH值有关,在低pH环境（pH5.0）中药物释放较快,72h内的累积释放量为62.0%,但在pH6.8或pH7.4的释放介质中,药物释放依次减慢,72h的累积释放量分别为46.4%和30.1%。4.载阿霉素CHSP纳米粒的体外HepG2细胞摄取研究载药纳米粒的体外细胞毒实验结果表明,不同浓度的游离DOX和载药纳米粒与HepG2细胞分别孵育72h,二者对HepG2细胞的生长均显示出一定的抑制作用,并且随着DOX浓度的增加,二者对HepG2细胞生长的抑制作用均增强。根据量效曲线计算得到游离DOX的IC50为2.36μg/mL,而载DOX的纳米粒的IC50为0.99μg/mL表明,载DOX的纳米粒对HepG2细胞的毒性更大。采用流式细胞仪对HepG2细胞摄取的DOX进行定量,结果表明,随着孵育时间的增加,HepG2细胞摄取DOX的量也增大。当孵育时间大于2h,HepG2细胞摄取载药纳米粒的量要多于游离DOX。采用CLSM以及定量分析软件分别对药物的亚细胞分布进行定位和定量分析结果表明,由于游离药物与载药纳米粒的摄取机制不同,孵育30min,游离DOX主要分布在细胞核中,并且随着孵育时间的增加,细胞以及细胞核中的DOX也增多。孵育30min,载药纳米粒主要分布在胞浆中；1h后部分载药纳米粒分布于溶酶体中,细胞核中DOX显著增加,并且随着孵育时间的增加,细胞、溶酶体以及细胞核中的DOX也增加。孵育4h时,载药纳米粒实验组细胞以及细胞核中的DOX均多于游离DOX实验组。在研究的孵育时间（4h）内,载药纳米粒实验组以及游离DOX实验组细胞分布在高尔基体、内质网以及线粒体中的DOX量很少,随着孵育时间的增加,在上述细胞器中的含量无明显变化。综上所述,CHSP纳米粒具有良好的生物相容性,能通过网格蛋白介导的内吞以及巨胞饮途径快速进入HepG2细胞,同时HepG2细胞对载DOX的CHSP纳米粒的摄取能力要比游离DOX强,载药纳米粒对HepG2细胞的毒性明显大于游离DOX,提示与游离DOX相比,载药纳米粒可在较低剂量下达到较高疗效。CHSP纳米粒有望成为一种新型的肝癌治疗药物载体。