论文摘要
食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是我国常见的恶性肿瘤,严重威胁人民群众的健康。经过多年研究,虽然其诊断与治疗状况有了很大的发展,但其发病率仍居高不下,5年生存率仍在15%-24%左右,并未得到根本性的改善。导致食管癌治疗失败的主要原因是肿瘤的复发,而造成其复发主要原因就是体内仍残存有癌细胞。两种主要因素导致体内癌细胞残留,即癌细胞的转移和肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,前者受癌细胞的自身生物学特性影响,后者则受癌细胞耐药基因的调控。乳腺癌耐药蛋白（BCRP）作为一种肿瘤多药耐药（MDR）蛋白,同时也被认为是肿瘤干细胞的标志,因此其不仅仅影响到肿瘤的耐药性,而且还对肿瘤的很多其他生物学特征有影响,包括侵袭性、增殖能力、致瘤性等。通过研究BCRP对肿瘤的生物学特性的影响以及对转移、复发、化疗药物耐药性的关系,对指导临床上对肿瘤的早期诊断与治疗、判断患者的预后均有重大的意义,这些已在一些肿瘤中有了初步的研究,但目前尚无BCRP在食管癌生物学特性中的作用以及和食管癌转移、复发、耐药性的关系。因此,有必要对食管癌中BCRP的表达以及其作用做一个研究。鉴于以上原因,本实验首先研究BCRP在食管鳞状细胞癌组织中的表达及与患者病理分型、转移、复发、预后等的关系,然后通过建立表达BCRP的食管鳞状细胞癌细胞系来研究BCRP在食管癌耐药性中的作用及对其生物学特性的影响,并探讨其可能的机理,为食管癌的早期珍断和治疗提供新的思路和理论依据。第一部分BCRP在食管鳞癌中的表达及其临床病理意义目的:研究BCRP在人食管癌组织中的表达及与临床病理的相关性,以初步探讨BCRP在人食管癌中表达的生物学意义。方法:50例新鲜食管癌及对应癌旁正常食管组织标本,采用免疫组化法和Western-blot检测BCRP蛋白的表达,30例2年前手术的食管癌石蜡标本,采用免疫组化法检测BCRP蛋白的表达,结合临床资料对实验结果统计分析,探寻BCRP基因在人食管癌中表达的临床意义。结果:1、Western-blot结果显示食管癌组织中BCRP的蛋白表达水平高于癌旁组织,经图像分析系统分析表明,癌与癌旁组织BCRP和β-actin产物条带积分光密度值之比分别为0.37±0.19和0.30±0.15,BCRP蛋白在食管癌组织中的表达水平为正常组织的1.22倍,统计分析显示差异有显著统计学意义（P＜0.01）。2、免疫组化结果显示在食管癌组织中有50%为BCRP阳性,癌旁组织为33.75%,两者有显著统计学意义（P＜0.01）;3、BCRP表达程度与患者中期生存率及早期复发相关（P＜0.05）,与其他临床因素无关。（4）、术前化疗可引起癌组织BCRP的上调结论:BCRP上调表达于食管鳞癌组织,其表达与患者中期生存率、患者的早期复发有关,可以作为判断肿瘤预后的标记;化疗药物可引起BCRP的上调表达。第二部分表达BCRP的食管鳞癌可传代细胞系的建立目的:通过建立表达BCRP的食管癌可传代细胞系,为下一步研究BCRP在食管癌中的作用奠定基础。方法:通过化疗药物cDDP和羟喜树碱作用于食管癌可传代细胞株,筛选出食管癌耐药细胞株。流式细胞仪检测细胞株中BCRP阳性细胞的比例,Western-blot和细胞免疫荧光检测该细胞株中的BCRP的蛋白表达情况。检测细胞中已知对顺铂耐药起关键性作用的谷胱甘肽—S转移酶（GST）、肺耐药蛋白（LRP）的表达,检测P-gp和MRP1在细胞株中的表达,将其与BCRP表达的升高进行相关性分析,以对化疗药物引起食管鳞癌中BCRP升高的机制做初步的探讨。结果:建立了对顺铂耐药的细胞株SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0,流式细胞仪检测SHEC-4、SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、和SHEC-4-D-1.0中BCRP阳性细胞的比率依次上升,SHEC-4与其他三种细胞的BCRP阳性细胞比率有统计学差异（p＜0.01）,其他三种细胞系之间的差异无统计学意义（p＞0.05）,Western-blot结果显示SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75和SHEC-4-D-1.0中BCRP的蛋白表达水平高于SHEC-4,细胞免疫荧光显示SHEC-4无荧光细胞,而SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75和SHEC-4-D-1.0中均可见大量的荧光细胞。LRP在SHEC-4与SHEC-4-D-1.0中的表达与其他细胞系有统计学差异（p＜0.05）,GST在四种细胞系中的表达依次升高,有统计学意义（p＜0.01）。结论:通过化疗药物筛选建立了高表达BCRP的食管癌可传代细胞株。顺铂引起BCRP升高的机制可能和顺铂筛选的耐药细胞同时高表达BCRP及其他耐药蛋白有关第三部分BCRP对食管鳞癌耐药性的作用目的:研究食管癌可传代细胞系的耐药性与BCRP的关系,探讨BCRP在食管癌耐药中的作用。方法:1、BCRP的表达对食管癌耐药性的作用:SHEC-4、SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75和SHEC-4-D-1.0分别用不同浓度的cDDP、5-FU、卡铂、羟喜树碱、柔红霉素进行处理48小时,绘制细胞抑制率曲线,计算细胞耐药指数（RF）,评价其对化疗药物耐受性的差异。2、抑制BCRP和GST活性后食管癌耐药细胞系的耐药性的变化:将BCRP的特异性抑制剂双嘧达莫和GST的特异性抑制剂利尿酸与细胞系共培养,分别用不同浓度的cDDP、5-FU、卡铂、羟喜树碱、柔红霉素进行处理,绘制细胞抑制率曲线,计算细胞耐药指数（RF）及抑制剂的逆转指数（RI）。并与未加抑制剂的细胞系进行比较。结果:SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0对cDDP、卡铂、柔红霉素、羟喜树碱的耐药指数均升高,而对5-FU的耐药指数降低。在加入双嘧达莫后,SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0对柔红霉素、羟喜树碱的RI降低,而对其他药物的RF无明显影响;加入利尿酸后,SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0对cDDP、卡铂的RF下降,对其他药物的RF无明显影响。结论:BCRP的高表达是引起食管癌耐药的一个重要原因。第四部分BCRP对食管鳞癌细胞系生物学特性的影响目的:研究BCRP对食管鳞癌细胞系生物学特性具有何种作用方法:检测食管癌可传代细胞系SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0与SHEC-4的生物学性状的异同。包括:一、BCRP对食管癌可传代细胞系体外生物学性状的作用:1、细胞形态观察;2、免疫组织化学染色检测细胞爬片的CK及Ki67表达3、细胞生长方面的检测:生长曲线、平板克隆形成率、细胞贴壁率、细胞周期;4、细胞运动实验;5、Transwell小室细胞侵袭性实验;二、BCRP对食管癌可传代细胞系体内生物学性状的作用;1、裸鼠接种成瘤实验:将不同浓度的ECCs接种于Balb/C裸鼠背部皮下,观察裸鼠皮下出现移植瘤的时间及所需细胞量;2、成瘤组织的常规病理及成瘤细胞的再培养3、流式细胞仪及western-blot检测成瘤组织中BCRP的表达;结果:一、BCRP对食管癌可传代细胞系体外生物学性状的作用:SHEC-4较另三种细胞体积略大,四种细胞形态差别不大;四种ECCs均呈CK及Ki67阳性,生长曲线均呈“S”型,群体倍增时间分别为28.79h、34.98h、35.69h、35.8h,后三组ECCs的群体倍增时间与SHEC-4相比明显延长,有显著的统计学意义（p＜0.01）。后三组细胞系在平板形成细胞数大于50个的克隆形成率较SHEC-4明显上升,但无统计学意义（p＞0.05）;ECCs冻存复苏后细胞的接种率分别为70%～81%;细胞周期显示SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0的S期比例增加,SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0的细胞迁徙能力和细胞侵袭能力均较SHEC-4明显上升。二、BCRP对食管鳞癌可传代细胞株体内致瘤性的影响接种1×105个瘤细胞的SHEC-4、SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0在4周后各分别有75%、75%、100%、75%成瘤,接种1×104个瘤细胞SHEC-4未见成瘤,而SHEC-4-D-0.3、SHEC-4-D-0.75、SHEC-4-D-1.0的成瘤率均为25%,接种1×103个瘤细胞的成瘤率分别为0%、25%、50%和25%,接种1×102个瘤细胞组均未成瘤。成瘤的体积无明显差别。体内的肿瘤细胞的形态和BCRP含量与亲代无明显差别。结论:BCRP在食管鳞状细胞癌中的表达明显提高了肿瘤细胞的增殖能力、致瘤性、侵袭性,可能与食管癌的转移、复发相关。全文总结1、BCRP上调表达于食管鳞癌组织,其表达与患者中期生存率、患者的早期复发有关,化疗后患者BCRP表达升高,说明某些食管鳞癌天生具有耐药性,化疗药物可以调高BCRP在癌组织中的表达,BCRP可以作为预测患者的预后的一个指标。2、利用顺铂对ECCs进行筛选可建立高表达BCRP的食管鳞癌可传代细胞株,BCRP的表达升高的可能机制是BCRP与其他耐药蛋白如LRP共表达于同一细胞亚群并被优势克隆,因此,在临床上使用化疗药物会可能导致BCRP的高表达。3、BCRP的上调使食管癌对某些化疗药物（喜树碱类、柔红霉素等）具有耐药性,这些耐药性可为BCRP的抑制剂所逆转,为临床上解决食管癌对化疗药物的耐药提供了思路。4、BCRP的高表达在体内和体外均与食管鳞状细胞癌ECCs的增殖能力、侵袭性、致瘤性有关,可能与食管癌的转移、复发相关。
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