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清热化瘀Ⅱ号方对急性脑缺血损伤NF-κBp65蛋白及其关键靶因子表达的影响

2020-11-28阅读(998)

清热化瘀Ⅱ号方对急性脑缺血损伤NF-κBp65蛋白及其关键靶因子表达的影响

论文摘要

目的：通过研究清热化瘀Ⅱ号方对急性脑缺血损伤NF-κBp65蛋白及其关键靶因子表达的影响,探讨清热化瘀Ⅱ号方对急性脑缺血损伤的防治作用及其机理。方法：课题分临床研究和实验研究两部分。1.临床研究：根据随机、盲法、对照的原则,严格遵循诊断、纳入标准,共收集急性缺血性脑梗死病例72例,随机分成治疗组与对照组,分别给予清热化瘀Ⅱ号方和天丹通络胶囊口服,14天为一个疗程,于治疗前后分别检测全血CD54、CD62P、白细胞、血小板以及血清S100B蛋白的含量和神经功能缺损及中医证候积分。2.实验研究：（1）实验一：采用脑缺血再灌注损伤动物模型,将实验SD大鼠随机分成6组,即假手术组、模型组、脑血栓片组、清热化瘀Ⅱ号方低、中、高剂量组,于缺血2h后再灌注3h、6h、12h、24h、48分别取材,测定梗死脑组织含水量,观察大鼠缺血脑组织病理变化及海马CA1区IL-8、TNF-α的表达,并用流式细胞术检测大鼠全血CD54、CD62P的阳性表达率。（2）实验二：采用脑缺血再灌注动物模型,将实验SD大鼠随机分成7组,即空白组、假手术组、模型组、对照组、清热化瘀Ⅱ号方低、中、高剂量组,于缺血2h后再灌注3h、6h、12h、24h、48不同时间点取脑,采用Western-blot实验技术测定缺血脑组织IκBα蛋白与NF-κBp65蛋白的表达水平。结果：1.临床研究：（1）治疗组治疗急性脑梗死临床总有效率为88.24%,治疗中医证候的总有效率91.18%,而对照组分别为74.28%和71.43%,差异有显著性意义（P<0.05）；（2）治疗组改善神经功能缺损程度和中医证候积分的作用显著优于对照组（P<0.01～0.05）。（3）治疗组具有显著抑制全血CD54、CD62P表达、减少白细胞及血小板计数、降低血清S100B蛋白的含量等作用,其疗效优于对照组（P<0.01～0.05）。2.实验研究：（1）实验一,①模型组大鼠可见海马区严重神经元坏死、丢失、排列紊乱和脑水肿,而药物干预组大鼠海马区以神经元变性为主,轻度神经元坏死、丢失及排列紊乱；②清热化瘀Ⅱ号方可明显抑制TNF-a、IL-8、CD54、CD62L的表达,显著降低缺血脑组织含水量,与模型组及对照组比较均有显著性差异。（P<0.01-0.05）。（2）实验二,①模型组IκBα蛋白在脑缺血再灌注各时间点表达减少,与假手术及空白组比较,差异有显著性（P<0.01）；药物干预各组中则见IκBα蛋白表达较模型组增加（P<0.01）,而以清热化瘀Ⅱ号方中、高剂量组IκBα蛋白表达增加显著。②模型组NF-K Bp65蛋白在脑缺血再灌注不同时间点的表达则明显增多,与假手术及空白组比较,差异有显著性（P<0.01）。而药物干预各组中则见NF-κBp65蛋白表达较模型组明显减少,而以清热化瘀Ⅱ号方中、高剂量组NF-κBp65蛋白表达减少更为显著（P<0.01）。结论：1、清热化瘀Ⅱ号方抑制血液CD54、CD62P的表达并下调血清S100B蛋白的含量水平,降低血小板与白细胞黏附,阻止缺血→炎症→血栓→再缺血的恶性循环,减轻早期的细胞毒性脑水肿及随后的血管源性脑水肿,缩小梗死面积,加快神经细胞损伤的恢复而显著改善神经功能缺损程度和中医证候积分。2、清热化瘀Ⅱ号方能阻止缺血再灌注后IκBα被降解,减少NF-K B的释放,使下游靶因子的转录与表达降低,炎症减轻,进一步控制缺血再灌注损伤而引起的IκBα再解离,从分子水平上打破炎性损伤的恶性循环而发挥治疗作用。3、清热化瘀Ⅱ号方下调细胞因子（IL-8、TNF-a）与黏附分子（CD54、CD62L）的表达,抑制NF-κB的激活,阻断脑缺血再灌注炎性损伤通路上的不同环节,进而抑制NF-κB与IκBα的分离,最终下调NF-κBp65转录与表达,抑制缺血—炎症的启动,对急性脑缺血损伤有重要的意义。4、清热化瘀Ⅱ号方通过阻断瘀血→痰饮→热毒→血瘀的恶性链锁反应而打破缺血→炎症→血栓→再缺血的恶性循环,血瘀、痰饮、热毒与炎症、血栓均有密切关系,临床治疗缺血性脑梗死,应重视多因素病机,进行多途径干预,实现多环节调控。

论文目录

  • 缩略词表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 引言
  • 临床研究
  • 第一部分 临床资料与方法
  • 1 病例选择标准
  • 1.1 诊断标准
  • 1.2 纳入病例标准
  • 1.3 排除病例标准
  • 1.4 剔除病例标准
  • 1.5 中止和撤出试验标准
  • 2 临床资料
  • 3 治疗方法
  • 4 观察指标
  • 4.1 安全性观察
  • 4.2 疗效性观察
  • 5 疗效评定标准
  • 5.1 脑卒中临床疗效评定标准
  • 5.2 中医证候疗效判定标准
  • 5.3 安全性评定标准
  • 6 统计分析
  • 6.1 数据集选择
  • 6.2 对脱落病例的统计原则
  • 6.3 统计方法选择
  • 6.4 统计软件包
  • 6.5 统计要求
  • 第二部分 结果与分析
  • 1 两组可比性分析
  • 1.1 两组年龄、性别、病程的比较
  • 1.2 两组梗死体积的比较
  • 1.3 两组病情程度的比较
  • 1.4 治疗前两组神经功能缺损积分及中医证候积分可比性分析
  • 2 两组脑梗死临床疗效比较
  • 3 两组神经功能缺损评分疗效比较
  • 4 两组中医证候疗效比较
  • 5 两组治疗前后中医证候积分值比较
  • 6 两组治疗前后全血CD54阳性表达百分率比较
  • 7 两组治疗前后全血CD62P阳性表达百分率比较
  • 8 两组治疗前后血清S100B蛋白含量比较
  • 9 两组治疗前后血液学参数的比较
  • 9.1 治疗前后白细胞计数及分类的比较
  • 9.2 两组血小板计数的比较
  • 第三部分 小结
  • 实验研究
  • 实验一 清热化瘀Ⅱ号方对大鼠缺血再灌注损伤脑组织病理形态学、脑组织含水量、TNF-α、IL-8、ICAM-1、CD62L表达的影响
  • 第一部分 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 实验药物
  • 1.3 实验试剂
  • 1.4 实验设备
  • 2 实验方法
  • 2.1 动物分组
  • 2.2 药物剂量换算
  • 2.3 给药途径与时间
  • 2.4 大鼠脑缺血再灌注模型建立及判断标准
  • 2.5 标本采集与处理
  • 3 统计学方法
  • 第二部分 结果与分析
  • 1 各组大鼠脑组织含水量的变化
  • 2 病理形态学观察
  • 2.1 海马区神经元病理变化
  • 2.2 缺血坏死区形态学观察
  • 3 免疫组化检测结果
  • 3.1 TNF-α的表达
  • 3.2 IL-8的表达
  • 4 流式细胞术检测CD54、CD62L结果
  • 4.1 各组大鼠全血CD54阳性表达率的变化
  • 4.2 各组大鼠全血CD62L阳性表达率的变化
  • 实验二:清热化瘀Ⅱ号方对大鼠缺血再灌注损伤脑组织中NF-κBp65、I κ B α蛋白表达的影响
  • 第一部分 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 实验药物
  • 1.3 实验试剂
  • 1.4 实验设备
  • 2 实验方法
  • 2.1 动物分组
  • 2.2 药物剂量换算
  • 2.3 给药途径与时间
  • 2.4 大鼠脑缺血再灌注模型建立及判断标准
  • 2.5 组织取材
  • 2.6 蛋白提取
  • 2.7 蛋白含量测定
  • 2.8 SDS-PAGE电泳
  • 2.9 考马斯亮蓝染色及脱色
  • 2.10 免疫印迹操作
  • 2.11 凝胶图象分析
  • 3 统计学处理
  • 第二部分 结果与分析
  • 1 Western-blot法检测IκBα蛋白的表达
  • 1.1 结果
  • 1.2 分析
  • 2 Western-blot法检测NF-κBp65蛋白的表达
  • 2.1 结果
  • 2.2 分析
  • 讨论
  • 1 缺血性中风的病证特点
  • 1.1 缺血性中风发病机理
  • 1.2 缺血性中风证治沿革
  • 1.3 缺血性中风病理基础
  • 1.4 缺血性中风炎症机理
  • 2 缺血性中风防治的指导思想
  • 2.1 未病先防——活血化瘀以干预缺血性中风发生的各种危险因素
  • 2.1.1 益气活血以延缓瘀阻脑络的病损进程
  • 2.1.2 疏肝活血以控制血压升高的危险因素
  • 2.1.3 滋阴活血以阻断消渴致瘀的恶性循环
  • 2.2 已病防变——瘀痰热毒并治以阻断缺血性中风的病损进程
  • 2.2.1 瘀阻脑络为基本病机
  • 2.2.2 痰瘀互结为关键环节
  • 2.2.3 痰热腑实为病理机转
  • 2.2.4 瘀毒阻塞为恶化根源
  • 2.2.5 瘀热伤络为病理核心
  • 2.2.6 瘀热致炎为恶性循环
  • 3 脑缺血再灌注损伤的病理机制
  • 4 谨守病机以遣药组方
  • 5 动物模型及实验方法学选择
  • 5.1 局灶性脑缺血动物模型的选择与评价
  • 5.2 关于流式细胞术的选用
  • 5.3 关于Elisa法测定S100B的实验原理
  • 5.4 关于Western-blot实验技术的选用
  • 6 关于对照药的选择
  • 7 清热化瘀Ⅱ号方疗效评价及作用机制探讨
  • 7.1 清热化瘀Ⅱ号方对急性脑梗死患者S-100B蛋白表达的影响
  • 7.2 清热化瘀Ⅱ号方对NF-κB调控的黏附分子表达的影响
  • 7.2.1 对急性脑缺血损伤ICAM-1表达的影响
  • 7.2.2 对急性脑缺血损伤CD62P表达的影响
  • 7.2.3 对急性脑缺血损伤CD62L表达的影响
  • 7.2.4 清热化瘀Ⅱ号方切断血小板-白细胞黏附而抗脑缺血损伤
  • 7.3 清热化瘀Ⅱ号方对脑缺血再灌注损伤NF-κBp65及IκBa蛋白表达的影响
  • 7.3.1 NF-κBp65与脑缺血炎症损伤
  • 7.3.2 IκBa与NF-κB的关系
  • 7.3.3 清热化瘀Ⅱ号方对IκBα及NF-κBp65蛋白表达的影响
  • 7.4 清热化瘀Ⅱ号方对NF-κB调控的细胞因子表达的影响
  • 7.4.1 对急性脑缺血再灌注损伤TNF-a表达的影响
  • 7.4.2 对急性脑缺血再灌注损伤IL-8表达的影响
  • 8 清热化瘀Ⅱ号方对脑缺血再灌注炎症损伤网络的影响
  • 9 清热化瘀Ⅱ号方对缺血→炎症→血栓→再缺血恶性循环的阻断作用 #111结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录一:综述
  • 附录二:攻读博士学位期间研究成果及发表论文
  • 附录三:附图
  • 附图一:FCM检测ICAM-1、CD62P表达图（A,临床研究部份）
  • 附图二:FCM检测ICAM-1、CD62L表达图（B,实验研究部份）
  • 附图三:Western-blot检测NF-κ Bp65、I κ B α表达图谱
  • 附图四:病理实验组织形态图

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