论文题目: 尿激酶型纤溶酶原激活物在人肺癌细胞中表达调控的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 童畅
导师: 朱运松,宋后燕,马端
关键词: 尿激酶型纤溶酶原激活物,酵母单杂交,电泳迁移率改变实验,核定位序列,突变体
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因,肿瘤细胞的转移是个多步骤、多阶段有序的复杂过程,它涉及细胞粘附、移动以及细胞基质的降解和重塑的复杂过程,一系列的蛋白水解酶如纤溶酶、基质金属蛋白酶、组织蛋白酶等参与此过程,其中尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)在这一过程中发挥重要的作用。uPA是一种丝氨酸蛋白水解酶,新合成的uPA是分子量约54kD的单链酶原,uPA与肿瘤细胞表面的受体(uPAR)结合,使uPA浓集于细胞表面,活性形式的uPA其丝氨酸蛋白酶结构域可水解激活纤溶酶原转变为纤溶酶,纤溶酶可直接降解基质组分或进一步激活金属蛋白酶降解基质,从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。uPA与uPAR结合后还可介导信号转导作用,引起细胞内一系列与细胞增殖、细胞迁移以及新生血管形成相关的基因表达,有利于肿瘤细胞的侵袭。大量的临床研究表明,在高侵袭性的恶性肿瘤中,uPA的表达都明显升高,与患者的预后不良明显相关。 尽管在转录后和蛋白质水平的调节也起着一定的作用,但大量的文献报道uPA基因表达的调节主要在转录水平。因此,研究uPA在转录水平的表达调控机制对于抑制细胞间基质的水解从而抑制肿瘤的转移很重要。目前uPA的启动子已克隆测序,研究表明,uPA启动子位于转录起始位点上游-1980bp处有一含有两个AP1位点的增强子序列,它在调节uPA启动子活性中起主要作用。在两个AP1位点之间有一74bp的增强子协调区(COM),文献报导在COM区可分为两部分,即上游的uCOM区,其序列为caatcagcatgacagcct,和下游的dCOM区,序列为atctggagtcatgagagct,EMSA的结果显示在uCOM区分别有四个反式因子与其结合,分别为UEF1、UEF2、UEF3和UEF4,在dCOM区有两个反式调节因子与其结合,分别为UEF1和UEF2,这些反式因子与COM区结合后协调AP1位点的主要反式转录因子发挥增强子的活性,目前UEF2、UEF3和UEF4的cDNA已先后被克隆,其表达产物已被纯化获得,它们协调AP1对uPA增强子的调节功能已基本明确。而在uCOM区和dCOM区都发挥作用的UEF1至今仍未被克隆和鉴定。对COM区UEF1的研究将有助于理解uPA转录调节机制。 为了寻找与uPA增强子dCOM区相互作用的UEF1蛋白以及这种相互作用对uPA表达调控的影响,我们构建了95C和95D细胞的cDNA文库,并以这段uPA增强子的dCOM区为诱饵,利用酵母单杂交系统筛选与dCOM相互作用的
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 95C和95D细胞cDNA文库的构建、扩增及鉴定以及与uPA增强子dCOM区结合的蛋白质的筛选
引言
材料与方法
实验结果
uPA增强子的dCOM区与95D和95C细胞核蛋白的EMSA
cDNA文库的构建和鉴定
酵母单杂交诱饵质粒的构建
酵母单杂交筛选95D和95C细胞的cDNA文库
阳性克隆的鉴定及其同源性比较
讨论
小结
第二部分 PBK1蛋白的原核表达、纯化及与uPA增强子dCOM区的体外相互作用
引言
材料与方法
实验结果
重组6xHis与PBK1融合蛋白表达质粒的构建和鉴定
6xHis-PBK1融合蛋白的原核诱导表达和纯化
6xHis.PBK1融合蛋白的纯化
PBK1蛋白可在体外环境下与uPA启动子的dCOM区结合
讨论
小结
第三部分 PBK1蛋白在各组织器官表达谱和在细胞内的定位以及对uPA启动子活性影响的研究
引言
材料与方法
实验结果
Real-time检测PBK1基因在正常各组织和95C和95D细胞中的表达谱
PBK1的真核表达质粒的构建
pEGFP-C3-PBK1质粒的瞬时转染和细胞内定位
PBK1的核定位序列和L1同源结构域缺失体的构建以及其细胞内定位
uPA启动子系列缺失突变体的构建
uPA启动子缺失突变体转染和荧光素酶活性测定
Western blot和ELISA分析PBK1过表达对uPA蛋白水平的影响
讨论
小结
总结与展望
综述
附录
致谢
论文独创性声明
论文使用授权声明
发布时间: 2005-09-19
参考文献
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标签：尿激酶型纤溶酶原激活物论文; 酵母单杂交论文; 电泳迁移率改变实验论文; 核定位序列论文; 突变体论文;