基于纳米银的抗感染创伤修复材料的研制及其性能评价

论文摘要

创伤感染及其并发症是导致创伤死亡的重要原因,同时也是临床上面临的一个非常棘手的问题。目前,预防和治疗创伤感染的最主要手段就是使用抗生素。然而,抗生素的滥用容易导致病原菌产生耐药性,并且会使其对药物的耐受性不断增强,最终导致了“超级细菌”的产生。因此,我们有必要寻找新的抗菌剂来代替抗生素。银作为一种优良的天然抗菌剂,已经有了几个世纪的应用史,其应用形式主要包括银离子、银单质和银复合物。纳米银具有极大的比表面积,增强了纳米银与微生物之间的相互作用,与其他形式的银相比具有更强的抗菌活性。此外,纳米银可以在细菌细胞内持续释放银离子,使纳米银的抗菌性能更持久。因此,纳米银用于抗感染已成为临床创伤治疗的研究热点之一。纳米银的应用效果与纳米银的特性密切相关,纳米银的颗粒大小、粒径分布、形貌、稳定性以及颗粒表面的理化状态都会对其应用产生影响。保护剂与纳米银颗粒结合可能会改变纳米银原有的生理化学特性,影响纳米银的细胞吸收、与生物大分子的相互作用以及纳米银在体内的迁移。葡聚糖作为一种天然的细菌性多糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性和抗感染活性,将其用于纳米银的修饰能否有效提高纳米银的理化特性和生物活性,目前尚未见报道。壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的衍生物,其具有良好的生物相容性、可控的生物降解性、无毒副作用、无抗原性等特点,在生物医学、组织工程、药物缓释等方面有着广阔的应用前景。目前有关壳聚糖海绵敷料的研究已有报道,其可大量吸收伤口渗出液并维持创面湿润环境,能够有效促进伤口的愈合。同时壳聚糖海绵还具有一定的止血和抑菌性能,能够促进创面处血管和上皮细胞的形成。因此,将纳米银与壳聚糖海绵复合用于创伤的修复和抗感染有望获得更为良好的治疗效果,然而上述假设还有待于进一步实验证实。本研究首先利用改良的化学还原法进行了葡聚糖修饰的纳米银的制备,并且对其物理性能进行了评价。在此基础上,对葡聚糖-纳米银的抗菌性能进行了检测,同时还对其细胞毒性进行了评价,并初步探讨了纳米银与细胞间的相互作用。其次,以葡聚糖-纳米银作为抗菌材料进行了壳聚糖-明胶海绵抗感染生物材料的制备,并且对海绵的性能进行了检测和评价。最后,以SD大鼠作为研究对象构建了创伤感染模型,并且对抗感染创伤修复材料的抗感染和创伤修复效果进行了评价。本论文主要包括以下四部分内容:第一部分:葡聚糖修饰的纳米银溶胶的制备及特征本研究通过对传统的化学还原法进行改良,以葡聚糖作为保护剂进行了纳米银溶胶的合成。对于合成的葡聚糖-纳米银,利用紫外-可见分光光度计、透射电子显微镜、X射线衍射仪和激光纳米粒度仪等对其物理特性进行了检测和评价,同时还将其与采用常规保护剂制备的PVP-纳米银进行了比较。结果表明,通过葡聚糖作为保护剂对纳米银进行修饰可以显著提高纳米银颗粒的均一性和稳定性。葡聚糖-纳米银颗粒呈球形或类球形,平均粒径约为8 nm,粒径分布窄。第二部分:葡聚糖-纳米银的生物学性能检测与评价本研究主要对葡聚糖-纳米银的抗菌性能和体外细胞毒性进行了评价。对于葡聚糖-纳米银的抗菌活性,首先利用固体平板法测定了不同纳米银载量对细菌生长的抑制情况,然后还研究了不同浓度纳米银对细菌生长动力学的影响。对于葡聚糖-纳米银的体外细胞毒性评价,本研究以小鼠纤维肉瘤细胞（L929）为研究对象,通过细胞形态观察、LIVE/DEAD染色分析和MTT检测来评价纳米银对细胞的毒性作用,研究了不同浓度纳米银对细胞形态和细胞增殖活力的影响。另外,本研究通过电子显微镜观察纳米银与细胞的相互作用,初步探讨了纳米银对细胞的毒性作用机制。抗菌检测结果表明,葡聚糖-纳米银对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有较强的抑制和杀灭作用,其最小抑菌浓度约为5.0μg/mL,最小杀菌浓度为10.020.0μg/mL。细胞毒性检测表明,当纳米银浓度大于10.0μg/mL时会对L929细胞产生明显的细胞毒性,细胞形态发生明显变化,细胞增殖受到抑制。纳米银可以通过胞吞作用进入细胞,与细胞内的多种细胞器相互作用而造成细胞损伤。第三部分:基于纳米银的壳聚糖-明胶海绵的制备本研究利用预冻-冷冻干燥法制备了复合纳米银的壳聚糖-明胶海绵,利用扫描电镜对海绵的表面形貌和内部结构进行了检测,同时对海绵的吸水溶胀性进行了评价,另外还通过抗菌实验对海绵的抗菌性能检测。结果表明,基于纳米银的壳聚糖-明胶海绵呈多层孔状结构,具有良好的吸水溶胀性。抗菌检测结果显示,纳米银的复合使海绵的抗菌性能显著增强。第四部分:大鼠创伤感染模型的构建及创伤修复实验本研究以SD大鼠作为研究对象,通过在大鼠背部切除1.5 cm×1.5 cm全皮,然后在创伤部位接种金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌（107cfu）来构建创伤感染模型。将大鼠创伤感染模型分4个组进行治疗:单纯壳聚糖-明胶海绵组、复合纳米银的壳聚糖-明胶海绵组、普通创伤敷料组和空白对照组。连续观察并记录伤面的愈合情况,利用激光多普勒血流仪对创面的血流灌注情况进行检测分析,最后通过组织学检测来评价不同治疗组对创面的修复效果。结果表明,基于纳米银的壳聚糖明胶海绵能有效发挥抗感染效果,促进创面结痂,使模型的创面愈合时间缩短35天。激光多普勒血流灌注检测表明,创面周边形成环形供血区,血流灌注明显最强,创面周边组织通过代偿性供血来促进创面愈合。组织学检测结果显示,复合纳米银的壳聚糖-明胶海绵能促进皮肤血管和毛囊结构的再生。综上所述,本研究成功制备了葡聚糖修饰的纳米银溶胶,该纳米银具有良好的均一性和稳定性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抑菌效果,这为新型抗菌剂的研制提供了一定的参考。此外,研究发现葡聚糖-纳米银的细胞毒性具有浓度依赖性,这为纳米银临床应用过程中的安全性评价提供了实验依据。最后,以葡聚糖-纳米银作为抗菌材料制备了基于纳米银的壳聚糖-明胶海绵,并且将其作为创伤敷料用于大鼠创伤感染模型的治疗和修复,证明了该创伤敷料在抗感染和创伤修复方面的良好效果。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分：葡聚糖修饰的纳米银溶胶的制备及特征
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分：葡聚糖-纳米银溶胶的生物学性能检测与评价
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分：基于纳米银的壳聚糖-明胶海绵的制备.
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四部分：大鼠创伤感染模型的构建及创伤修复实验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢