MdSPDS1基因的功能分析及转化毛白杨的初步研究

论文摘要

目前,土壤盐渍化严重影响农林业生产和生态环境,如何使大片的盐碱地以及丰富的咸水资源被充分利用,成为当前研究的热点问题。而多胺（polyamines,PAs）对提高植物抗逆性起着重要的作用,为此,本研究开展了对多胺合成途径中的相关基因苹果亚精胺合成酶（apple spermidine synthase genes1,MdSPDS1）的基因功能分析,并首次将其转入毛白杨（Populus tomentosa Carr.）中,从而提高转基因毛白杨的耐盐能力。本研究工作结果如下:（1）农杆菌介导法将MdSPDS1基因转入普通烟草（Nicotiana tabacum）中,采用实时荧光定量PCR方法和高效液相色谱法（HPLC）分别检测了植株中MdSPDS1基因的相对表达情况,以及三种主要多胺——腐胺、亚精胺、精胺（Put、Spd、Spm）的含量,结果发现转MdSPDS1基因的烟草中Spd含量是非转基因的2-3倍。（2）在初步探讨MdSPDS1基因功能中,耐盐性分析时发现MdSPDS1表达量高的转基因烟草D14可以在400mM的NaCl胁迫下生存,在进一步的多胺含量变化趋势测定中,结果表明Spd的含量和（Spd+Spm）/Put比值的增加对提高植物的耐盐性起到重要的作用。同时在转基因烟草抗病性分析中,D14的抗烟草花叶病毒（TMV）能力强于为转基因植株WT,WT植株感病后,Put含量比初始增加了5倍多,而D14中Spd含量增加4倍左右,暗示Spd的增加可能是促进植物抗烟草花叶病毒能力提高的原因。（3）初步建立了毛白杨遗传转化体系,对卡那霉素抗性芽进行了PCR和Southern检测,结果表明,成功获得了转MdSPDS1基因的毛白杨植株。并测定了转基因毛白杨中MdSPDS1基因相对表达量和多胺的含量,其中T7的Spd含量是未转化植株的1.65倍。转基因毛白杨耐盐性初步分析中发现转MdSPDS1基因的毛白杨可以在200mM的盐胁迫下生存。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 植物耐盐基因工程研究进展
• 1.1.1 耐盐相关基因的研究
• 1.1.1.1 脯氨酸（Proline）
• 1.1.1.2 甜菜碱（Betaine）
• 1.1.1.3 多元醇（Polyol）
• 1.1.1.4 糖类（Glucide）
• 1.1.2 植物耐盐育种研究进展
• 1.1.2.1 利用野生种质材料进行选育
• 1.1.2.2 组织细胞培养
• 1.1.2.3 分子育种
• 1.2 多胺的生理代谢在环境胁迫中的作用
• 1.2.1 多胺的基本生物合成途径
• 1.2.2 多胺与植物逆境胁迫的关系
• 1.2.2.1 多胺与酸胁迫的关系
• 1.2.2.2 与低温胁迫的关系
• 1.2.2.3 与渗透胁迫的关系
• 1.2.2.4 与干旱胁迫的关系
• 1.2.2.5 与盐胁迫的关系
• 1.2.2.6 多胺与生物胁迫的关系
• 1.2.3 多胺的基因转化
• 1.2.3.1 ADC 的基因转化
• 1.2.3.2 SAMDC 的基因转化
• 1.2.3.3 SPDS 的基因转化
• 1.3 本研究立项依据与技术路线
• 2 农杆菌介导的 MdSPDS1 转化烟草
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 菌种和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 农杆菌培养基（YEB 培养基）
• 2.1.2.2 烟草遗传转化培养基
• 2.1.3 试验方法
• 2.1.3.1 农杆菌的活化及工程菌液的制备
• 2.1.3.2 叶盘法遗传转化的步骤
• 2.1.3.3 转基因植株的PCR 扩增检测
• 2.1.3.4 实时荧光定量PCR 分析
• 2.1.3.5 多胺含量的测定方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 农杆菌介导转化与抗性筛选
• 2.2.2 转基因植株的PCR 检测
• 2.2.3 实时荧光定量PCR 分析
• 2.2.4 多胺含量的测定
• 2.3 讨论
• 3 MdSPDS1 转基因烟草抗逆性初步鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 转基因烟草组培苗耐盐性试验与检测
• 3.1.2.2 转基因烟草的病毒接种试验与检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转基因烟草耐盐性分析
• 3.2.1.1 耐盐性试验
• 3.2.1.2 盐胁迫下多胺含量分析
• 3.2.2 转基因烟草抗烟草花叶病毒分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 多胺与盐胁迫的关系
• 3.3.2 多胺与生物胁迫的关系
• 4 毛白杨转MdSPDS1 基因的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 卡那霉素敏感性测定
• 4.1.2.2 农杆菌的活化及工程菌液的制备
• 4.1.2.3 转化及筛选
• 4.1.2.4 转基因植株的PCR 扩增检测
• 4.1.2.5 Southern 分析
• 4.1.2.6 MdSPDS1 基因表达量分析及多胺含量的测定
• 4.1.2.7 转基因毛白杨耐盐性分析
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 卡那霉素临界浓度试验
• 4.2.2 转化植株的获得和生根
• 4.2.3 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 4.2.4 转基因植株的Southern blot 检测
• 4.2.5 MdSPDS1 表达量和多胺含量的分析
• 4.2.6 转基因毛白杨耐盐性分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 农杆菌介导的MdSPDS1 基因的转化
• 4.2.2 多胺含量的测定
• 4.2.3 转 MdSPDS1 基因毛白杨耐盐性的提高
• 5 结论与研究展望
• 5.1 结论
• 5.2 研究展望
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢