RNA干扰抑制HepG-2细胞DNA-PKcs基因表达对放射敏感性影响的实验研究

论文题目: RNA干扰抑制HepG-2细胞DNA-PKcs基因表达对放射敏感性影响的实验研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 影像医学与核医学

作者: 王春刚

导师: 田建明

关键词: 干扰,放射敏感性,肿瘤

文献来源: 第二军医大学

发表年度: 2005

论文摘要: 放射治疗是肿瘤治疗的基本方案之一,大约70%的肿瘤患者需要接受放射治疗。理论上,足够大的放射剂量能够杀死所有肿瘤细胞,但周围正常组织的放射损伤常常限制剂量增加。细胞DNA是电离辐射的主要靶点,后者通过直接和间接作用导致DNA链断裂,其中DSB是致死性的。真核细胞修复DSB的主要途径是NHEJ和HRR两种机制。哺乳动物体细胞主要修复方式是NHEJ,其中涉及DNA-PKcs,Ku,DNA ligase Ⅳ,XRCC4等蛋白以及一系列尚未发现的因子。 DNA-PK是NHEJ最重要的功能蛋白。作为丝/苏氨酸蛋白激酶,它由DNA-PKcs及Ku组成。Ku募集DNA-PKcs到DNA末端,形成DNA-PK全酶。激活的DNA-PK磷酸化一系列DNA结合蛋白,启动断端连接反应。 DSB修复缺陷的细胞对射线敏感性增加以及对射线耐受的细胞DSB修复蛋白高表达等现象从正反方面说明DSB修复与放射敏感性具有相关性,因此,抑制修复基因表达成为放射增敏的基本策略之一。诸多实验结果表明,通过抑制DNA-PKcs的表达可以阻断DSB修复,从而提高细胞的放射敏感性。 RNA干扰是利用与目的mRNA具有同源性的siRNA诱发序列特异性的转录后基因沉默的现象,它产生类似于“基因敲除”的生物表型,能够高效、特异地抑制靶基因,具有投入少、周期短、操作简单等优点。本课题在前人研究的基础上,构建细胞稳定表达siRNA的实验技术平台,在mRNA、蛋白质水平观察其对人肝癌细胞株HepG-2 DNA双链断裂修复基因DNA-PKcs表达的抑制作用,并在细胞水平观察其放射敏感性的影响,从而探讨稳定表达siRNA抑制DNA-PKcs基因表达对HepG-2细胞放射敏感性的影响,为肿瘤的放射增敏研究提供一条新的思路,同时进一步探讨DSB修复的作用机制。本课题选择人肝癌细胞株HepG-2 DSB修复基因DNA-PKcs作为靶基因,根据文献中证实针对DNA-PKcs基因有效的siRNA,合成63-64nt的寡核苷酸,经过退火与经BamH Ⅰ和HindⅢ酶切的线性化质粒pSilencer2.1-U6定向连接,转化大肠杆菌DH5α。连接成功的质粒分别命名为pSilencer-1、pSilencer-2。另以AMBION公司的错乱序列作为阴性对照,命名为pSilencer-C。这些质粒均经过PCR和测序鉴定。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分

材料

方法

结果

讨论

第二部分

材料

方法

结果

讨论

第三部分

材料

方法

结果

讨论

总结

参考文献

综述

在校期间发表论文

致谢

发布时间: 2005-07-19

参考文献

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RNA干扰抑制HepG-2细胞DNA-PKcs基因表达对放射敏感性影响的实验研究

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