小麦族仲彬草属植物的细胞学和生化标记以及ITS序列分析

论文摘要

仲彬草属Kengyilia Yen et J.L.Yang是颜济和杨俊良于1990年以戈壁仲彬草Kengyilia gobicola Yen et J.L.Yang为模式种建立的一个小麦族多年生属。到目前为止，共有26个种和6个变种，主要分布于中国、俄罗斯及邻国，大多分布在帕米尔高原、喀喇昆仑山脉、阿尔泰山脉、天山山脉、祁连山脉、喜马拉雅山脉及其青藏高原地区，生长于海拔1100～5100 m的草甸、草原、荒漠之中。颜济和杨俊良，周永红、时英等、Jensen和张新全等学者通过细胞学研究表明，该属植物为六倍体物种（2n=6x=42），具有StYP染色体组。从分类地位看，不同学者有不同的处理，存在着较大的分歧。陈守良和耿以礼将这组植物放在鹅观草属中；Tzvelev将它们组合到偃麦草属短穗组中；Love和Jensen以及卢宝荣等把这些植物放在广义披碱草属中。从种间关系来看，周永红等和张利等利用RAPD和RAMP分子标记表明，分布于新疆和青藏高原的仲彬草属物种存在较大的遗传变异，种间具有丰富的遗传多样性。蔡联炳和智力通过形态比较将K.melanthera处理为K. thoroldiana var. melanthera和把K.melanthera var. tahopaica处理为K. hirsuta var. tahopaica，随后，又对仲彬草属物种了进行了系统整理，并根据形态特征进行了系统发育分析。以后，不断地将有新种和新组合组合到该属中。因此，目前关于仲彬草属植物的系统分类地位、物种界限以及种间和种内亲缘关系等问题还存在较大分歧。本研究利用Giemsa-C带、醇溶蛋白电泳、同工酶电泳和ITS序列的系统发育分析探讨仲彬草属的遗传多样性和种间亲缘关系，旨在为仲彬草属植物种质资源保护和利用提供理论依据。其主要结果如下：（1） Giemsa-C带分析的结果表明：仲彬草属物种具有不同C带带型特征。K.gobicola具有明显的着丝粒带特征和部分不显带的染色体。而K.hirsuta，K.longiglumis，K. rigidula和K.thoroldiana则具有更丰富和相似的C带带纹特征，中间带和端带特征明显，表明了较近的亲缘关系。（2）醇溶蛋白电泳分析的结果表明：仲彬草属植物种间和种内存在丰富的遗传变异。35份材料共产生了59条不同的谱带，各个材料分离出了7～34条不等的条带，多态性高达100％。仲彬草属植物具有丰富的醇溶蛋白多态性。醇溶蛋白的遗传相似系数变化范围为0.537～0.905，平均值为0.721。对所有材料进行聚类分析和主成分分析发现，在GS值为0.721的水平上供试材料可以聚成3个类群。在Ⅰ类中包括K.longiglumis，K. thoroldiana，K. kokonorica，K. stenachyra，K. grandiglumis，K. rigidula，K.mutica，K.melanthera，K. melanthera var. tahopaica和K. hirsuta聚类在一起。在Ⅱ类中，K.nana，K.alatavica，K.batalinii和K.kaschgarica聚类在一起。来源于新疆的K.gobicola三份材料聚为第Ⅲ类。物种内不同居群聚在一起，遗传系数较大，亲缘关系较近。形态相似、地理分布相同的物种具有一定的亲缘关系，种间的遗传变异大于种内不同居群间的遗传变异，并且存在一定程度的地理分化。（3）酯酶同工酶电泳分析的结果表明：仲彬草属植物具有丰富的遗传变异，28份仲彬草材料检测到迁移率不同的19条酶带，各材料分别具有2～8条酶带，多态性高达100％。酯酶同工酶的遗传相似系数变化范围为0.427～0.805，平均值为0.616。聚类分析和主成分分析表明，在GS值为0.616的水平上所有材料可以聚成4个类群。在Ⅰ类中，K.mutica，K.stenachyra，K.longiglumis，K.grandiglumis，K.kokonorica，K.rigidula聚在一起。K.hirsuta，K.melanthera以及K.melanthera var. tahopaica聚为Ⅱ类。K.alatavica单独聚为Ⅲ类。在Ⅳ类中，K.batalinii，K.tahelacana，K. gobicola，K. nana和K. kaschgarica聚为一类。同一物种不同地理分布的首先聚类在一起。相同或相近地理分布的物种聚类在一起，具有较近的亲缘关系。种间的遗传变异大于种内不同居群间的遗传变异，并且揭示了仲彬草属植物存在一定程度的地理分化，与醇溶蛋白的结果基本一致。（4）对仲彬草属植物的10个种分别进行了ITS序列PCR产物的直接测序和克隆测序比较分析。结果表明，K.tahelacana，K.batalinii和K.goicola聚类在一起，具有较近的亲缘关系。K.kokonorica，K.hirsuta，K.grandiglumis，K.zhaosuensis，K.mutica，K.rigidula和K.melanthera聚类在一起，表明具有较近的亲缘关系。在进行仲彬草的系统发育分析，克隆序列反映的系统学关系与形态学、地理分布、细胞学、分子标记分析结果基本一致，仲彬草属物种出现了地理分化，来自相同或相似的地理分布的物种具有较近的亲缘关系。因此，采用克隆测序的方法对仲彬草属植物系统发育分析比直接测序的方法更能反映该属植物的系统学关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 仲彬草属植物分类现状
• 1.2 仲彬草属植物研究进展
• 1.2.1 形态学研究
• 1.2.2 细胞学研究
• 1.2.2.1 细胞学标记
• 1.2.2.2 染色体组分析
• 1.2.3 分子生物学研究
• 1.2.3.1 DNA分子标记
• 1.2.3.2 5SrRNA基因研究
• 1.2.4 资源评价和利用
• 1.3 Giemsa-C带研究
• 1.4 醇溶蛋白研究
• 1.5 酯酶同工酶研究
• 1.6 ITS序列系统发育研究
• 2 前言
• 3 材料与方法
• 3.1 供试材料
• 3.2 研究方法
• 3.2.1 Giemsa-C带分析
• 3.2.1.1 培根
• 3.2.1.2 制片
• 3.2.1.3 染色
• 3.2.1.4 有关试剂配制
• 3.2.2 醇溶蛋白电泳分析
• 3.2.2.1 数据统计与分析
• 3.2.3 酯酶同工酶电泳分析
• 3.2.3.1 数据统计与分析
• 3.2.3.2 有关试剂配制
• 3.2.4 ITS序列比较分析
• 3.2.4.1 基因组总DNA的提取
• 3.2.4.2 ITS片段的PCR扩增及产物回收
• 3.2.4.3 产物的连接和转化
• 3.2.4.4 阳性克隆筛选
• 3.2.4.5 ITS系统发育树的构建
• 4 结果与分析
• 4.1 Giemsa-C带分析
• 4.1.1 Kengyilia gobicola带型分析
• 4.1.2 Kengyilia hirsuta带型分析
• 4.1.3 Kengyilia longiglumis带型分析
• 4.1.4 Kengyilia rigidula带型分析
• 4.1.5 Kengyilia thoroldiana带型分析
• 4.2 醇溶蛋白电泳分析
• 4.2.1 供试材料醇溶蛋白多态性
• 4.2.2 供试材料的醇溶蛋白遗传相似系数
• 4.2.3 基于Nei-Li遗传相似系数的聚类分析和主成分分析
• 4.3 酯酶同工酶电泳分析
• 4.3.1 供试材料的酯酶酶谱多态性
• 4.3.2 基于Nei-Li遗传相似系数的聚类分析和主成分分析
• 4.4 ITS序列直接测序和克隆测序分析
• 4.4.1 ITS序列PCR产物直接测序分析
• 4.4.2 ITS序列PCR产物克隆测序分析
• 4.4.3 ITS序列的系统发育树构建比较分析
• 5 讨论
• 5.1 基于C-带细胞学资料探讨仲彬草属植物的亲缘关系
• 5.2 基于醇溶蛋白探讨仲彬草属植物亲缘关系
• 5.3 基于酯酶同工酶探讨仲彬草属植物亲缘关系
• 5.4 基于ITS序列探讨仲彬草属植物亲缘关系
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文