堆肥生境中木质纤维素降解微生物和酶系的初步研究

论文摘要

木质纤维素是陆地光合作用的产物,是生物圈中丰富的可再生资源。木质纤维素的资源化利用在一定程度上能够缓解能源危机,但是该过程存在着瓶颈-纤维素生物质转化成可发酵多糖效率低。要解决这一问题,首要的策略是筛选高效的木质纤维素降解酶系。天然生境中木质纤维素降解酶系丰富多样的特点使之成为酶系筛选的主要目标。不依赖于培养的方法能够比较全面的研究天然生境中木质纤维素降解微生物和酶系,为工业用酶的筛选奠定了基础。本文首先建立了快速展示木质纤维素降解酶系各组分的活性电泳方法；后以秸秆堆肥为主要研究对象,用不依赖于培养的生物化学、分子生物学方法分析整个过程、不同时间秸秆的降解情况、酶系的活力、组成和微生物多样性。以小麦秸秆为底物连续降解32天,检测发现该过程中纤维素、半纤维素的含量逐渐降低,纤维素降解率为67.5%,半纤维素降解率为43.3%；薄壁组织基本上完全降解,降解程度较大。小麦秸秆堆肥样品降解32天过程中木质纤维素降解相关酶活力和多样性呈现有规律的动态变化。木聚糖酶、纤维素内切酶和外切酶在降解中期均达到最大值。发酵中期纤维素内切酶、木聚糖酶组分多样性最高,活性条带数量分别可达7条和10条。直接提取小麦秸秆、玉米秸秆堆肥样品的总DNA,纯化并进行PCR-RFLP检测,结果显示小麦秸秆降解样品100个转化子中有59%是未培养细菌,其余20%、6%、5%分别属于变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门,已知的细菌有17种；玉米秸秆100个转化子中有57%的细菌属于未培养,其余的35%和8%的细菌分别属于变形菌门和厚壁菌门,已知的细菌有15种。两个样品中都有与木质纤维素降解相关的细菌,如芽孢杆菌属、纤维弧菌属、假单胞菌属、梭菌属等,但是种类和数量较少。秸秆堆肥过程中木质纤维素降解相关酶系多样性丰富,并且存在主要的酶组分,秸秆底物的降解效率高；这都证明天然生境中有高效的木质纤维素降解微生物。但是对细菌多样性的分析发现主要的纤维素降解者较少,这是由于研究方法以及微生物的未培养特性造成的。在之后的实验中,尝试使用蛋白组学与基因组学分析相结合的方法,将堆肥过程中降解酶系和微生物——对应,为微生物和酶系的筛选提供理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• Abbreviation
• 第1章 绪论
• 1.1 木质纤维素的生物降解
• 1.1.1 木质纤维素的组成和结构
• 1.1.2 木质纤维素降解真菌及酶系
• 1.1.3 木质纤维素降解细菌及酶系
• 1.2 木质纤维素降解系统中微生物群落的分析
• 1.2.1 微生物群落研究的限制因素
• 1.2.2 以生物化学为基础的微生物群落研究方法
• 1.2.3 以分子生物学为基础的微生物群落研究方法
• 1.3 立题依据
• 第2章 木聚糖酶的性质电泳
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 木聚糖酶制剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 木聚糖酶性质测定（3,5-二硝基水杨酸法）
• 2.1.5 木聚糖酶活性电泳（Native-PAGE）
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 木聚糖酶制剂活性展示
• 2.2.2 黑曲霉AN76粗酶液中木聚糖酶组分性质测定
• 2.2.3 不同酶制剂活性条带的展示
• 2.3 讨论
• 第3章 不同堆肥系统中生物质降解酶系的初步分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验样品
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 实验试剂
• 3.1.4 粗酶液的制备
• 3.1.5 酶活力测定
• 3.1.6 活性电泳（Native-PAGE）
• 3.1.7 纤维含量的测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 以玉米秸秆为原料的降解系统
• 3.2.2 以小麦秸秆为原料的堆肥
• 3.3 讨论
• 第4章 小麦秸秆堆肥过程秸秆降解和酶系变化的分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验仪器
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 酶活力测定
• 4.1.4 小麦秸秆堆肥方式
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 小麦秸秆堆肥过程取样照片
• 4.2.2 温度、pH的变化
• 4.2.3 秸秆降解程度
• 4.2.4 木质纤维素降解相关酶系的变化
• 4.3 讨论
• 第5章 不同堆肥系统的细菌多样性分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验仪器
• 5.1.3 实验试剂
• 5.1.4 样品总DNA的提取（液氮研磨法）
• 5.1.5 纯度和产量测定
• 5.1.6 总DNA的纯化
• 5.1.7 16S rDNA基因克隆及引物序列
• 5.1.8 堆肥样品细菌16S rDNA文库的构建
• 5.1.9 基因文库RFLP分析和测序
• 5.1.10 多样性分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 玉米秸秆、小麦秸秆样品总DNA的提取
• 5.2.2 Sepharose4B纯化样品总DNA
• 5.2.3 细菌通用引物16S rDNA PCR
• 5.2.4 16S rDNA基因文库的构建和筛选（RFLP）
• 5.2.5 测序结果比对
• 5.3 讨论
• 全文总结与展望
• 全文总结
• 展望
• References
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表