卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究及中华补血草LsNHXs基因的功能研究

论文摘要

第一章卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究甲基溴是在全球被广泛采用的一种熏蒸杀虫剂,但是,甲基溴对臭氧层和环境有破坏作用。国际组织呼吁尽快淘汰甲基溴,因此,甲基溴替代技术的开发迫在眉睫。卤代甲烷的生物合成由以下酶促反应完成:SAM（S-腺苷甲硫氨酸）+ X-（Cl-,Br-,I-）→CH3X + S-adenosylhomocysteine（S-腺苷高半胱氨酸）,反应由一种甲基转移酶（methyl chloride transferase MCT）催化完成。本实验克隆了来源于甜土植物—拟南芥及来源于盐生植物—盐芥和盐地碱蓬的MCT基因AtMCT（AtHOL）、ThMCT和SsMCT。通过基因工程手段将这三个基因转入烟草,实现基因的过量表达。土壤甲基溴熏蒸的目标在于杀死具有较高耐药性的病源物的孢子或其他休眠形式,熏蒸所需浓度高,这也是造成环境污染的原因。通过转基因手段,赋予转基因烟草微量、持续产生甲基溴的能力,病源物侵染时可直接对其作用,从而替代甲基溴土壤熏蒸。此技术在国内外尚属首创。主要实验结果如下:1)利用RT-PCR和RACE方法克隆获得ThMCT和SsMCT基因的全长序列。ThMCT基因全长923 bp,开放阅读框为681 bp,共编码226个氨基酸,蛋白分子量约为25.1 KD。SsMCT基因全长1094 bp,开放阅读框为699 bp,共编码232个氨基酸,蛋白分子量约为25.8 KD。2)将AtMCT、ThMCT和SsMCT的全长ORF构建到植物双元表达载体pINT4中,用农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草,分别获得了18个AtMCT、20个ThMCT和38个SsMCT基因独立的转化株系。3)对转基因植株进行分子鉴定。PCR分析、Southern和Northern杂交结果表明外源基因已整合进烟草的基因组中并正常转录。用总蛋白作Western杂交,三种转基因植株均有杂交信号。但是如果主要用可溶性蛋白作Western杂交,则只有AtMCT转基因植株有杂交信号,而ThMCT和SsMCT转基因植株均没有杂交信号。4)用不同浓度的处理液处理野生型和转基因烟草,用气/质联用仪测定其CH3Cl、CH3Br和CH3I的释放量。AtMCT转基因植株a12三种气体的释放量明显高于野生型对照,是对照的100倍左右,而ThMCT和SsMCT转基因植株的释放量和对照差异不明显。5)对AtMCT转基因植株a12和野生型植株接种线虫,在施加Br-,增加底物的情况下,AtMCT转基因植株提高了对线虫的抗性。第二章中华补血草LsNHXs基因的功能研究液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐逆密切相关,它利用液泡膜H+-ATPase及H+-PPase泵H+产生的驱动力把Na+区隔化入液泡中以消除Na+的毒害,除此之外,液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白还与PH调节、囊泡运输、液泡的发育以及蛋白质分选有关。液泡不仅是一个物质储存细胞器,在特定的生理条件下,某些植物细胞的液泡可参与矿质离子、简单糖类、有机酸和氨基酸等物质的运输。早期的电镜观察发现,补血草盐腺分泌细胞内有大量的线粒体和丰富的内质网,缺少清晰的中央大液泡,但细胞内有许多液泡样的小囊泡,小囊泡大部分都靠近细胞质膜且经常出现与质膜的融合,推测囊泡运输参与了补血草的泌盐过程。由此推测补血草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白LsNHXs将对补血草的泌盐产生一定的影响。因此,本实验克隆了LsNHXs基因,并利用RNAi技术对其功能进行了研究。主要实验结果如下:1)采用RT-PCR和3’-RACE方法从补血草中克隆获得LsNHXs基因家族三个成员LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的保守区序列以及LsNHX2和LsNHX3的3’端特异序列。2)构建植物基因RNAi沉默表达载体并转化补血草,获得三个单基因和一个双基因的RNAi沉默表达植株,快繁转基因植株供分子鉴定和耐逆分析。3)LsNHX1转基因植株叶片表面分泌物中的Na+、K+离子含量比野生型对照显著增加;叶组织内Na+离子含量和K+离子含量均略高,但差异不显著;K+/Na+比没有显著差异。4)LsNHX2转基因植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比野生型对照有所下降,但差异不显著;K+离子含量比对照显著降低。LsNHX2转基因植株叶组织内Na+离子含量略高,但差异不显著;K+离子含量和K+/Na+比均降低。5)LsNHX3转基因植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比对照增加,但差异不显著,K+离子含量比对照增加,在400 mM NaCl条件下达到显著差异;叶组织内Na+离子含量和K+离子含量均略高;K+/Na+比没有显著差异。6)LsNHX1+LsNHX2双基因沉默植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比野生型对照增加,K+离子含量与野生型对照相比没有显著差异。转基因植株叶中Na+离子含量略高,但差异不显著;转基因植株叶中K+离子含量及K+/Na+比均降低。以上结果表明,LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的作用机制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上,沉默表达后,区隔化的Na+离子含量降低,导致通过囊泡运输分泌的Na+离子含量降低。LsNHX1和LsNHX3可能定位于中央大液泡上,主要负责Na+的区隔化;沉默表达后,液泡中区隔化的Na+离子含量降低,胞质中的Na+离子含量增加,刺激盐腺泌盐,导致叶片分泌的Na+离子含量增加。本研究的主要创新点:1.首次克隆了盐生植物—盐芥、盐地碱蓬的卤代甲烷甲基转移酶基因ThMCT和SsMCT,并对其序列特征进行了详细的分析。2.通过过量表达卤代甲烷甲基转移酶基因,提高转基因烟草释放甲基溴的能力,使转基因烟草微量、持续产生甲基溴,从而替代甲基溴土壤熏蒸。此技术在国内外尚属首创。3.首次克隆了补血草的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白LsNHXs基因家族三个成员LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的部分序列,并将这三个基因分别作了RNAi沉默表达。研究发现LsNHX1、LsNHX2、LsNHX3的作用机制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上,通过囊泡运输对补血草的泌盐起一定的作用,而LsNHX1和LsNHX3可能定位于中央大液泡上,主要负责Na+的区隔化。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 一、卤代甲烷酶促合成机制
• 1 卤代甲烷的生物产生机制
• 2 卤代甲烷甲基转移酶基因的克隆
• 3 卤代甲烷酶促反应机制的生物学意义
• 4 卤代甲烷的植物发生论
• +/H⁺逆向转运蛋白'>二、Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白的分子特性及转运机制'>1 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的分子特性及转运机制
• +/H⁺逆向转运蛋白的进化分类和亚细胞定位'>1.1 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的进化分类和亚细胞定位
• +/H⁺逆向转运蛋白的拓扑结构和功能残基'>1.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的拓扑结构和功能残基
• 1.2.1 NHE 的结构与功能调节
• +/H⁺逆向转运蛋白C 端的功能'>1.2.2 酵母和真菌质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白C 端的功能
• +/H⁺逆向转运蛋白的结构'>1.2.3 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的结构
• +/H⁺逆向转运机制'>1.3 大肠杆菌EcNhaA 的Na⁺/H⁺逆向转运机制
• +/H⁺逆向转运蛋白'>2 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白基因家族'>2.1 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因家族
• +/H⁺逆向转运蛋白阳离子选择性'>2.2 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白阳离子选择性
• +/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性'>2.3 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性
• +/H⁺逆向转运蛋白的其它功能'>2.4 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的其它功能
• +/H⁺逆向转运蛋白与囊泡运输'>3 NHE/NHX Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与囊泡运输
• +/H⁺逆向转运蛋白'>4 植物质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白与植物耐逆的关系'>4.1 植物质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物耐逆的关系
• 4.2 SOS 信号通路
• 4.2.1 SOS 信号通路元件
• 4.2.2 SOS 信号通路
• 4.2.3 SOS 信号通路的保守性
• 4.3 AtNHX8
• 三、囊泡介导的植物细胞可溶性物质的转运
• 1 囊泡参与盐的分泌
• 2 囊泡参与蜜的分泌
• 3 囊泡参与有机酸和蔗糖的分泌
• 4 囊泡参与保卫细胞和运动细胞的溶质运输
• 5 囊泡参与糖和黏附多糖的分泌
• 四、本实验的意义
• 1 甲基溴替代技术的开发
• 2 中华补血草泌盐机制探讨
• 第二部分 实验论文
• 第一章 卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究
• 一、实验材料
• 1 植物材料及线虫
• 2 菌种及质粒
• 3 酶及化学试剂
• 4 主要仪器设备
• 5 质粒提取液
• 6 培养基
• 7 引物序列
• 二、实验方法
• 1 基本分子生物学实验技术
• 1.1 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 1.2 质粒的提取
• 1.3 PCR、酶切以及连接
• 1.4 Gene Clean 方法从琼脂糖凝胶上回收外源基因片段
• 1.5 植物基因组DNA 的提取及Southern 杂交膜的制备
• 1.5.1 植物基因组DNA 的提取—CTAB 法
• 1.5.2 Southern 杂交膜的制备
• 1.6 Trizol 试剂提取植物总RNA
• 1.7 异硫氰酸胍法提取植物总RNA 及Northern 杂交膜的制备
• 1.7.1 植物组织总RNA 的提取—异硫氰酸胍法
• 1.7.2 Northern 杂交膜的制备
• 1.7.2.1 RNA 甲醛变性胶电泳
• 1.7.2.2 RNA 杂交膜的制备
• 1.8 Southern 杂交和Northern 杂交分析
• 1.8.1 cDNA 探针的制备
• 1.8.2 杂交过程
• 1.8.3 洗膜及显影
• 1.9 Western 杂交
• 1.9.1 植物蛋白的提取方法一
• 1.9.2 植物蛋白的提取方法二—丙酮沉淀法
• 1.9.3 SDS-PAGE
• 1.9.4 转膜
• 1.9.5 Western 检测
• 2 ThMCT、SsMCT 基因的克隆
• 2.1 ThMCT、SsMCT 基因保守区的克隆
• 2.2 ThMCT、SsMCT 基因5’端序列的克隆
• 2.3 ThMCT、SsMCT 基因3’端序列的克隆
• 3 AtMCT、ThMCT 和SsMCT 基因过量表达载体的构建
• 4 植物表达载体的农杆菌转化与鉴定
• 5 农杆菌介导的烟草转化
• 6 转基因烟草的PCR 鉴定
• 7 转基因烟草卤代甲烷释放量的测定
• 8 转基因烟草的线虫抗性实验
• 三、实验结果
• 1 MCT 基因的克隆及序列分析
• 1.1 ThMCT 基因的克隆
• 1.2 SsMCT 基因的克隆
• 1.3 ThMCT 和SsMCT 的氨基酸序列分析
• 1.4 ThMCT 和SsMCT 的系统谱系分析
• 1.5 AtMCT、ThMCT 和SsMCT 的拓扑结构分析
• 2 AtMCT、ThMCT 和SsMCT 基因过量表达载体的构建
• 3 植物表达载体的农杆菌转化与鉴定
• 4 农杆菌介导的烟草转化
• 5 转基因烟草的分子鉴定
• 5.1 转基因烟草的PCR 分析
• 5.2 转基因烟草的Southern 杂交分析
• 5.3 转基因烟草的Northern 杂交分析
• 5.4 转基因烟草的Western 杂交分析
• 6 转基因烟草卤代甲烷释放量的测定
• 7 转基因烟草的线虫抗性实验
• 四、讨论
• 1 ThMCT 和SsMCT 的序列特征
• 2 过量表达AtMCT 提高了转基因烟草对线虫的抗性
• 第二章 中华补血草LsNHXs 基因的功能研究
• 一、实验材料
• 1 植物材料
• 2 菌种及质粒
• 3 酶及化学试剂
• 4 主要仪器设备
• 5 质粒提取液
• 6 培养基
• 7 引物序列
• 二、实验方法
• 1 基本分子生物学实验技术
• 1.1 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 1.2 质粒的提取
• 1.3 PCR、酶切以及连接
• 1.4 Gene Clean 方法从琼脂糖凝胶上回收外源基因片段
• 1.5 植物基因组DNA 的提取及Southern 杂交分析
• 1.6 Trizol 法和异硫氰酸胍法提取植物总RNA
• 1.7 CTAB 改良法提取中华补血草总RNA
• 1.8 DNaseI （RNase Free） 去除补血草RNA 中的基因组DNA
• 2 中华补血草LsNHXs 基因的克隆
• 2.1 中华补血草LsNHXs 基因保守区的克隆
• 2.2 LsNHX2 和LsNHX3 基因3’端序列的克隆
• 3 LsNHXs 基因RNAi 沉默表达载体的构建
• 3.1 LsNHX1、LsNHX2、LsNHX3 单基因RNAi 沉默表达载体的构建
• 3.2 LsNHX1+LsNHX2 双基因RNAi 沉默表达载体的构建
• 4 植物表达载体的农杆菌转化与鉴定
• 5 中华补血草的遗传转化
• 5.1 农杆菌菌液的制备
• 5.2 补血草叶片的转化
• 5.3 抗性芽的生根
• 5.4 抗性苗的快速繁殖及移栽
• 6 转基因补血草的分子鉴定
• 6.1 转基因补血草的PCR 鉴定
• 6.2 转基因补血草LsNHXs 基因表达的Real-time PCR 分析
• 6.2.1 补血草RNA 的提取及定量
• 6.2.2 RNA 的反转录及cDNA 模板的稀释
• 6.2.3 实时定量PCR 引物的设计
• 6.2.4 实时定量PCR（Real-time PCR）
• 6.2.5 Real Time PCR 数据分析的方法
• 7 转基因补血草的耐逆性分析
• 7.1 野生型与转基因补血草的快速繁殖
• 7.2 野生型与转基因补血草的盐胁迫处理
• +、K⁺离子含量的测定'>7.3 叶片表面分泌物中Na⁺、K⁺离子含量的测定
• 7.4 叶面积的测定
• +、K⁺离子含量的测定'>7.5 叶片组织内Na⁺、K⁺离子含量的测定
• 7.6 植物材料含水量的测定
• 三、实验结果
• 1 中华补血草LsNHXs 基因的克隆
• 1.1 中华补血草RNA 的提取
• 1.2 中华补血草LsNHXs 基因保守区的克隆
• 1.3 LsNHX2 和LsNHX3 基因3’端序列的克隆
• 2 LsNHXs 基因RNAi 沉默表达载体的构建
• 2.1 LsNHXs 单基因RNAi 沉默表达载体的构建及酶切验证
• 2.1.1 LsNHXs 单基因RNAi 沉默表达载体的构建
• 2.1.2 LsNHXs 单基因RNAi 沉默表达载体的酶切验证
• 2.2 LsNHX1+LsNHX2 双基因RNAi 沉默表达载体的构建及酶切验证
• 3 植物基因RNAi 沉默表达载体的农杆菌转化及PCR 验证
• 4 中华补血草的遗传转化
• 5 转基因补血草的分子鉴定
• 5.1 转基因补血草的PCR 鉴定
• 5.2 转基因补血草的Southern 杂交分析
• 5.3 转基因补血草LsNHXs 基因表达的Real-time PCR 分析
• 6 转基因补血草的耐逆性分析
• 6.1 LsNHX2 转基因补血草的耐逆性分析
• 6.1.1 LsNHX2 转基因补血草在不同盐胁迫条件下的生长情况
• 6.1.2 盐处理对LsNHX2 转基因植株与野生型植株含水量的影响
• +、K⁺离子含量的影响'>6.1.3 盐处理对LsNHX2 转基因植株与野生型植株叶片表面分泌物中Na⁺、K⁺离子含量的影响
• +、K⁺离子含量的影响'>6.1.4 盐处理对LsNHX2 转基因植株与野生型植株叶片组织内Na⁺、K⁺离子含量的影响
• +LsNHX2 转基因补血草的耐逆性分析'>6.2 LsNHX1、LsNHX3 和LsNHX1⁺LsNHX2 转基因补血草的耐逆性分析
• 6.2.1 LsNHX1、LsNHX3 和LsNHX1+LsNHX2 转基因补血草在不同盐胁迫条件下的生长情况
• 6.2.2 盐处理对LsNHX1、LsNHX3 和LsNHX1+LsNHX2 转基因植株与野生型植株含水量的影响
• +、K⁺离子含量的影响'>6.2.3 盐处理对LsNHX1 转基因植株与野生型植株叶片表面分泌物中Na⁺、K⁺离子含量的影响
• +、K⁺离子含量的影响'>6.2.4 盐处理对LsNHX1 转基因植株与野生型植株叶片组织内Na⁺、K⁺离子含量的影响
• +、K⁺离子含量的影响'>6.2.5 盐处理对LsNHX3 转基因植株与野生型植株叶片表面分泌物中Na⁺、K⁺离子含量的影响
• +、K⁺离子含量的影响'>6.2.6 盐处理对LsNHX3 转基因植株与野生型植株叶片组织内Na⁺、K⁺离子含量的影响
• +、K⁺离子含量的影响'>6.2.7 盐处理对LsNHX1+LsNHX2 转基因植株与野生型植株叶片表面分泌物中Na⁺、K⁺离子含量的影响
• +、K⁺离子含量的影响..'>6.2.8 盐处理对LsNHX1+LsNHX2 转基因植株与野生型植株叶片组织内Na⁺、K⁺离子含量的影响..
• 四、讨论
• 1 中华补血草RNA 的提取
• 2 RNAi 技术在植物功能基因组学研究中的应用
• +/H⁺逆向转运蛋白LsNHXs 对其耐盐性的影响'>3 中华补血草液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白LsNHXs 对其耐盐性的影响
• 图版
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢