论文摘要
研究背景子宫腺肌病（Adenomyosis, AM）是妇科常见疾病（8-62%）,近年来发病率呈上升趋势。其病理表现为子宫内膜腺体和间质存在于子宫肌层内,伴随周围肌层细胞的代偿性肥大和增生。80%为40岁年龄段妇女,20%是从未生育过的青年女性。65%的患者具有临床症状,包括经量增多、经期延长、痛经进行性加重,子宫增大（弥漫性均匀增大或局部结节性隆起）及不孕等,严重影响妇女的身心健康及家庭的生活质量。到目前为止发病机制尚不清。有关AM发病机制的学说很多,如基底内膜内陷学说、化生学说、淋巴及静脉播散学说等,其各种改变可能与遗传、免疫和激素水平的多重调控有关。其中广为接受的学说为基底内膜内陷学说。该学说认为子宫腺肌病是子宫基底内膜腺体浸润、子宫基底层内膜向下生长和内陷于子宫平滑肌层并异位增殖生长的结果。但其具体子宫内膜侵入肌层的机制尚不明确。本研究基于子宫内膜异位发生的在位内膜决定理论,从离子通道改变的角度探索腺肌症子宫平滑肌的离子通道改变与子宫内膜生长极向发生改变的可能关系。我们认为子宫腺肌症患者离子通道的改变,引起子宫的舒缩异常,可能导致内膜基底层细胞生长极向发生改变,逆向而背离腔面向肌层生长,从而形成子宫腺肌病。通过对既往妊娠期子宫收缩与子宫平滑肌离子通道改变相关文献的回顾发现,离子通道BKCa（包括α亚基和β亚基）、Kv4.2和Kv4.3对促使钾离子外流,去极化细胞膜即刻复极化甚至超极化使肌细胞复极到静电电位,从而间接地降低平滑肌的收缩力维持子宫平滑肌的静息状态起重要作用。该研究从离子通道的角度探讨子宫腺肌病的发生机制,是对在位内膜决定论的补充,并对该病的预防以及新的治疗药物的开发开辟新的思路。研究目的1观察子宫腺肌病患者子宫内膜生长的极向。2探讨子宫腺肌病子宫平滑肌细胞离子通道BKCaα亚基、BKCaβ亚基、Kv4.2和Kv4.3表达的改变。3研究体外培养子宫平滑肌细胞BKCaα亚基和Kv4.3的表达及雌孕激素对其表达量的影响。方法1 HE染色子宫腺肌病患者及对照组子宫全层组织,观察子宫内膜-平滑肌交界区（EMI）形态的改变和子宫内膜腺体由内向外逐步浸润的情况；2免疫组化法定位离子通道BKCaα亚基、BKCaβ亚基、Kv4.2和Kv4.3蛋白在子宫腺肌病患者病灶以及对照组平滑肌中的表达；3 LCM分离腺肌病灶子宫平滑肌组织与其内浸润的子宫内膜腺体和间质；4应用Real-time PCR法检测BKCaα亚基、BKCaβ亚基、Kv4.2和Kv4.3在子宫腺肌病患者病灶以及对照组平滑肌组织中mRNA表达量的改变；5体外培养并鉴定子宫腺肌病子宫平滑肌细胞,应用western和RT-PCR法检测BKCaα亚基和Kv4.3在子宫平滑肌细胞中的表达的改变；6以不同浓度的雌、孕激素作用于体外培养的子宫平滑肌细胞,RT-PCR法检测BKCaα亚基和Kv4.3在mRNA水平表达量的改变。结果1子宫腺肌病EMI不规则,可见多个内膜腺体及间质凸向肌层的乳头样突起,且子宫腺肌病患者子宫内1/3肌层腺体及间质浸润的面积明显高于外1/3肌层。推测子宫腺肌病肌层内的腺体及间质可能起源于这些乳头样突起,并由平滑肌内层向外层逐渐浸润生长而形成的；2离子通道BKCaα亚基、BKCaβ亚基、Kv4.2和Kv4.3蛋白在子宫腺肌病和对照组子宫平滑肌层和腺体（在位和异位）的细胞膜和胞浆中均有表达。其中BKCaβ亚基在对照组子宫内膜,Kv4.3在对照组平滑肌和内膜中均仅有少量表达；3激光捕获显微切割技术能够准确分离腺肌病灶内平滑肌、腺体及间质组织,分离组织可以用于进一步nRNA检测；4子宫腺肌病平滑肌组织中BKCaα亚基nRNA和Kv4.3mRNA表达明显高于对照组,其差异具有统计学意义；而BKCaβ亚基mRNA和Kv4.2mRNA在两组间无显著差异；5差速贴壁与差速脱壁相结合的体外培养分离方法,可以用于获得相对纯度满意的子宫腺肌病灶平滑肌细胞；6体外培养证实AM组子宫平滑肌细胞BKCaα和Kv4.3在蛋白表达和mRNA水平均较对照组显著升高；7雌激素对子宫平滑肌细胞BKCaα亚基mRNA和Kv4.3mRNA表达有一定抑制作用,而孕激素对其有促进表达作用,AM与对照组对不同浓度雌孕激素的反应不同。结论1本课题从组织形态学角度显示子宫内膜生长极向的改变并支持基底内膜内陷学说。2该实验从分于生物学角度观察BKCaα亚基、BKCaβ亚基、Kv4.2和Kv4.3蛋白在AM和对照组平滑肌、在位内膜和异位内膜的分布情况,并定量检测证实AM子宫平滑肌细胞BKCaα亚基mRNA和Kv4.3mRNA表达显著高于对照组,提示子宫平滑肌收缩相关离子通道的异常表达可能与腺肌病的发生相关。3体外培养AM组子宫平滑肌细胞BKCaα和Kv4.3在蛋白表达和mRNA水平均较对照组显著升高,进一步验证了平滑肌离子通道表达与腺肌病的相关性。4雌激素对子宫平滑肌细胞BKCaα亚基mRNA和Kv4.3mRNA表达有一定抑制作用,而孕激素对其有促进表达作用。但AM与对照组对不同浓度雌孕激素反应的不同,提示AM子宫平滑肌的异常舒缩可能是子宫平滑肌细胞与收缩相关离子通道与局部雌孕激素相互作用的结果。