用烟草蚀纹病毒防治玉米矮花叶病的研究

论文摘要

玉米矮花叶病是玉米生产上的一类重要病毒病,在世界各玉米产区都有发生,长期以来一直严重影响着玉米的产量和质量。在我国,自1968年首次报道河南新乡发生玉米矮花叶病害以来,该病害在我国北部和西北部地区均大面积发生,玉米产量损失在20%～80%,已经成为制约我国玉米生产的主要问题之一。本文在克隆玉米矮花叶病毒CP基因的基础上,运用生物学和分子生物学手段研究了烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus, TEV）与甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus, SCMV）之间的交互保护作用,证实了TEV与SCMV之间存在交互保护作用的现象,这不仅为植物病毒马铃薯Y属（Potyvirus）不同病毒间交互保护作用的研究奠定了基础,而且也开拓了植物病毒病防治的新思路。克隆了陕西分离物SCMV CP基因（登录号为DQ846832）,其基因序列与浙江SCMV CP基因的核苷酸同源率为99.79%,氨基酸的同源率为100%。在防虫网室内,对TEV与SCMV交互保护作用设计了四种处理方式,处理Ⅰ先用10%TEV保护接种玉米,7d后挑战接种10%SCMV,结果表明玉米在初期叶面光滑,色泽均匀, 10d后仅有13.8%的植株开始轻微褪绿,处理Ⅱ只挑战接种SCMV作为阳性对照的玉米,在前期心叶表现出褪绿症状,后期植株为典型玉米矮花叶症状;10d后全部发病。处理Ⅲ只保护接种TEV的玉米无症状,处理Ⅳ不接种任何病毒的玉米生长状况良好,健康无症状。通过PCR检测,结果发现,从只接种SCMV的玉米植株中扩增片段大小约为1.1kb,确定为SCMV CP基因;从先接种TEV再接种SCMV植株中同样检测到该基因,但条带较弱,而不接种任何病毒植株对照均未出现特异性扩增条带。进一步用实时荧光定量PCR检测,以只挑战接种的阳性对照为参照因子,其2-△△Ct值是经18S rRNA校正后1倍量的目的基因表达,△△Ct=0,2-△△Ct=1,对于处理组的样品,相对于参照因子目的基因表达的倍数为2-△△Ct。经保护接种的玉米在攻击接种50d后,植株体内病毒CP含量为未保护玉米的0.1134倍,远远低于只接种SCMV植株的表达量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 玉米病毒病的概况
• 1.2 交互保护作用的研究历史及现状
• 1.2.1 同种病毒间的交互保护作用
• 1.2.2 不同病毒间的交互保护作用
• 1.2.3 植物病毒间的交互保护作用的机理
• 1.3 玉米矮花叶病毒研究进展
• 1.4 实时荧光定量PCR 检测技术
• 1.4.1 荧光探针技术原理
• 1.4.2 TaqMan 探针
• 1.4.3 SYBR Green 荧光染料
• 1.4.4 绝对标准曲线法（Absolute Standard Curve）
• 1.4.5 相对标准曲线法（Relative Standard Curve）
• 1.4.6 扩增效率系统误差的校正
• 1.4.7 绝对分子含量的计算
• 1.4.8 相对分子含量的计算
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 玉米矮花叶病毒CP 基因的克隆
• 2.1 材料
• 2.2 所需仪器和试剂耗材
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 菌种、质粒和试剂
• 2.3 陕西分离物SCMV CP 基因的克隆及测序
• 2.3.1 病毒RNA 的提取和cDNA 的合成
• 2.3.2 SCMV CP 基因的克隆
• 2.3.3 PCR 产物纯化
• 2.3.4 连接反应
• 2.3.5 感受态细胞的制备
• 2.3.6 转化和筛选
• 2.3.7 重组质粒的鉴定
• 2.3.8 序列测定与同源性分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 RNA 的提取及检测
• 2.4.2 SCMV CP 基因的扩增
• 2.4.3 SCMV CP 基因测序结果
• 2.5 讨论
• 第三章 TEV 与SCMV 之间的交互保护作用
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试植物材料
• 3.1.2 供试毒源
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 生物防治试验处理
• 3.2.2 常规PCR 检测
• 3.2.3 实时荧光定量RT-PCR 法检测TEV 与SCMV 之间的交互保护作用
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 生物学结果
• 3.3.2 PCR 检测结果
• 3.3.3 Real-time PCR 检测结果
• 3.4 讨论
• 第四章 主要结论与研究设想
• 4.1 主要结论
• 4.2 研究设想
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 硕士期间发表论文
• 获奖情况