藤黄微球菌Rpf结构域及其突变体基因的克隆、表达及生物活性的初步研究

论文摘要

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）所致的、以呼吸系统感染为主的传染病。近年来,由于卡介苗（BCG）保护性的不完善、耐药MTB菌株的出现、艾滋病的流行以及人口流动等因素的增加,使得TB的发病率呈日益上升的趋势,再次成为危害人类健康的世界性疾病。BCG是目前预防TB的唯一疫苗,但其不能有效预防成人TB,因此,积极研究TB的致病及免疫机制,对于开发更为有效的诊断、预防和治疗TB的新技术具有重要意义。藤黄微球菌（M.luteus）中的复活促进因子（Resuscitation-promoting factor,Rpf）是第一个被发现的细菌生长因子,它具有促进休眠菌的复苏以及促进细菌快速生长的作用。序列对比分析发现,在其它的一些革兰氏阳性细菌如MTB、麻风分枝杆菌、蓝色链霉菌、谷氨酸棒杆菌等中也存在30多个与Rpf同源的蛋白。研究发现MTB基因组可编码5种Rpf样蛋白,分别为Rv0867C（Rpf A）、Rv1009（Rpf B）、Rv1884C（Rpf C）、Rv2389C（Rpf D）和Rv2450C（Rpf E）,推测这些蛋白也具有促进MTB快速生长的作用。此外,这些蛋白均具有Rpf样结构域,即高度保守的70aa残基,该保守区域对Rpf的复苏功能是至关重要的,单独的Rpf结构域具有与Rpf蛋白一致的生物学功能。进一步的研究发现,Rpf结构域中都有一个高度保守的谷氨酸残基（glu54）,为Rpf活性所必需,与溶菌酶催化活性相符。实验目的:利用大肠杆菌表达系统,表达并纯化出M. luteus Rpf结构域及其突变体蛋白,并进一步研究其生物学活性。实验方法和结果:1. Rpf结构域及其突变体蛋白的表达及纯化采用聚合酶链反应（PCR）从M. luteus基因组中扩增出Rpf结构域及其E54A和E54K两种突变体基因,用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中,经测序证实,与GenBank公布的序列完全相同,突变位点与设定一致。将测序正确的基因分别亚克隆到pGEX-4T-1表达载体中,酶切鉴定阳性重组质粒,转化大肠杆菌,并用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明成功地表达了Rpf结构域及其突变体融合蛋白,用Rpf结构域单克隆抗体（mAb）进行Western-blot分析证实,其大小为32kD,与预计的融合蛋白大小相符。用GS-4B亲和色谱柱纯化获得了目的蛋白。2. Rpf结构域及其突变体融合蛋白生物学活性的检测将耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,M.S）休眠菌以1:150的比例稀释。把各种融合蛋白按照不同的浓度加入到M.S休眠菌中,并分别用相应的抗体进行干预。37℃振荡培养,每4 h取少量培养液测A600nm值,根据测定结果绘制生长曲线图。结果表明:Rpf结构域蛋白对M.S具有促进复苏和促生长的作用,使M.S的培养周期缩短。而且Rpf结构域蛋白具有和Rpf蛋白相同的生物学活性。E54K突变后的Rpf蛋白对于M.S的生长有一定的抑制作用,而E54A无明显的抑制生长作用。结论:获得了Rpf结构域及其两种突变体蛋白E54K和E54A,Rpf结构域蛋白与完整的Rpf蛋白一样对M.S具有一定的复苏和促生长作用;而加入Rpf及Rpf结构域抗体后,其作用被抵消,使M.S维持正常生长。E54K突变体对于休眠的M.S的生长有一定的抑制作用。E54A对于休眠的M.S无明显的抑制作用。这些结果为研究Rpf结构域突变体在抑制M. luteus的生长,进而研究其对MTB生长的影响,以及Rpf结构域和其突变体抗体在TB预防及临床快速诊断中的作用奠定基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 Rpf结构域及其突变体基因的克隆、表达与蛋白纯化
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 实验二 Rpf 结构域及其突变体蛋白的生物活性测定
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢