论文摘要
牛肉具有蛋白质高、脂肪低、胆固醇低等营养优势,并且富含人类所需要的所有必需氨基酸和部分主要微量元素,正逐渐成为人类的主要肉类消费品。随着人们对牛肉性状、质量和营养上要求的提高,通过转基因技术繁育培养出具有优良性状的肉牛成为当今研究的热点。考虑到转基因的安全性,组织特异性启动子作为解决安全性问题的有力工具受到人们的重视。因此,在转基因肉牛的研究中,肌肉高效特异性启动子的研究具有重要意义。本研究旨在通过基因重组技术构建真核表达载体,利用转录因子结合位点分析和序列对比合成启动子和选择增强子,以期获得牛肌肉高效特异性启动子。应用PCR方法扩增牛骨骼肌alpha-actin、Mylpf和Ckm基因5’调控区片段,在质粒pGL3-Basic的多克隆位点插入基因片段构建真核表达载体,脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞和成纤维细胞,利用双荧光素酶报告基因检测系统比较alpha-actin、Mylpf、Ckm启动子的活性。以牛骨骼肌alpha-actin启动子转录起始位点前82bp和148bp片段为核心启动子,用合成的调控序列和核心启动子分别构成两个合成启动子,将两个核心启动子和两个合成启动子分别插入pGL3-Basic载体中构建成真核表达质粒;根据鼠肌肉肌酸激酶Ckm增强子位置和序列,经过序列比对和转录因子结合位点分析,在牛肌肉肌酸激酶5’调控区内找到有一段与鼠Ckm增强子相似的序列,为了验证该序列是否具有增强子的作用,将该序列分别连入合成启动子前构建成真核表达质粒。通过脂质体技术转染鲁西黄牛成肌细胞和成纤维细胞,利用双萤光素酶报告基因检测系统来检测合成启动子和增强子的活性。转染成肌细胞后,alpha-actin启动子活性较Mylpf和Ckm的活性高,转染成纤维细胞后,三种启动子的活性与空载体pGL3-Basic的相当,初步证实了以上三种启动子的肌肉特异性。两段核心启动子转染成肌细胞后均有活性,可作为核心启动子进行后期的合成启动子的构建;合成启动子转染成肌细胞后,合成的启动子调控元件可使82bp核心启动子活性提高大约140–400倍,使148bp核心启动子活性提高大约2–3倍,且以82bp为核心启动子构建的合成启动子活性是alpha-actin启动子活性的4–6倍,但是以148bp为核心启动子构建的合成启动子活性低于alpha-actin启动子的活性;增强子活性分析结果为,该序列可使合成启动子活性提高大约1–3倍,初步证明该序列具有增强子的作用,且连有增强子的82bp和148bp合成启动子其活性分别是alpha-actin启动子活性的9–11倍和2–3倍,其中连有增强子的82bp合成启动子活性约是CMV活性的1/6;将含有合成启动子和增强子的质粒转染成纤维细胞,活性分析结果与其在成肌细胞中的相当,初步说明合成的启动子和增强子缺乏细胞特异性。本实验比较了天然存在的肌肉特异性启动子的活性,得到了一个活性较高的合成启动子,且在牛肌肉肌酸激酶5’调控区找到了一段具有增强子作用的序列。本实验得到的合成启动子和增强子为提高外源基因在牛肌肉中高效表达提供了实验材料,为牛肌肉高效特异性启动子的获得和转基因肉牛的研究奠定了基础。