有血清和无血清体外培养树突状细胞的比较研究

论文摘要

目的:微小残留病（Minimal residual disease , MRD）是导致白血病复发的根本原因,人们一直在不断找寻根除 MRD 的方法,利用细胞因子诱导白血病患者产生大量的树突状细胞（Dendritic Cell , DC）,并以此作为抗原递呈细胞,诱导患者产生抗白血病的特异性细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）细胞,用之于临床,则不失为清除患者体内残留灶中肿瘤细胞的解决办法。目前多数体外培养基包含胎牛血清（FCS） 、混合人（AB 型） 血清或自体血清,由于血清中包含个体差异性的生长因子,异体血清又有外来抗原及危险感染侵入的弊端,人自体血清中又含有某些抑制 DC 生长的因子,这将使 DC 的临床应用受到限制。本实验采用无血清培养基 X-VIVO 20 则避免了上述缺点,且 X-VIVO 20 已经被美国 FDA 批准用于临床实验。本实验将通过观察 X-VIVO 20 对体外诱导扩增 DC 的支持能力,探索生物治疗的重要基本条件。同时,与含FCS、人 AB 血清的培养基对比,比较用 X-VIVO 20 的优缺点,为进一步优化无血清培养基条件、使 DC 疗法应用于临床提供实验依据。 方法:应用体外细胞液体培养、细胞化学染色、流式细胞仪（FACSCalibur）分析检测等技术进行实验。 1. 用 1.077g/L 淋巴细胞分离液分离获得正常人外周血单个核细胞（PBMNC）; 2. 用 GM-CSF、IL-4,在不同培养基中,37°C、5%CO2孵箱中培养6 天（培养过程中,培养基的选择包括:①含 10%人 AB 血清的RPMI1640;②含胎牛血清的 RPMI1640;③无血清培养基 X-VIVO 20;·2·④含 20g/L 人血白蛋白的 X-VIVO 20）, 第 6 天加入钙离子载体（CI）A23187 继续培养 1 天;3. DC 的形态学观察:用倒置显微镜每日观察细胞生长及形态变化情况,第 3、7 天作细胞计数,第 7 天作瑞氏—姬姆萨染色,观察摄片;4. DC 的表型分析:收集培养 7 天后的细胞,通过流式细胞术分析细胞表型 CD14、CDw123、CD83、HLA-DR;5. 混合淋巴细胞反应（MLR）:按照 MTT 法进行操作,用酶标仪检测波长 570nm 时的吸光度（A）值,并计算刺激指数（SI）,SI= A 实验组/A 对照组;6. K562 细胞、HL-60 细胞冻融抗原（frozen-thawed antigen , FTA）的制备:取 K562 细胞、HL-60 细胞,放入液氮及 37°C 水浴中,反复冻融 3 次, 4℃保存备用;7. DC 刺激的 T 细胞对 K562、HL-60 细胞的杀伤作用:采用 MTT法测定 T 细胞的杀伤活性,观察比较各组抗原负载 DC 对 T 细胞杀伤靶细胞的影响;结果:1. 各组均培养出典型的 DC,细胞体积增大,表面粗糙,核呈圆形、肾形、马蹄形、椭圆形等,偏位,嗜碱性染色, 胞质丰富,胞膜向外伸展,形成大量形状、粗细不等的毛刺状突起,细胞突起和胞浆呈嗜酸性染色。随着培养时间的延长,各组 DC 细胞数均增加,不同组间 DC 细胞数量差异无显著性（P>0.05）;2. 未处理的PBMNC 表面单核细胞的标志CD14分子呈高表达状态,而 CDw123、HLA-DR 及 CD83 分子的表达很弱或缺乏。培养后各组均出现成熟 DC 的特征性表面标志 CD83 分子表达增高,HLA-DR、CDw123 分子的表达也明显增高, 而 CD14 分子的表达明显减少。无血清培养基组与含血清培养基组表达相差不大,加入 20g/L 人血白蛋白无明显提高。不同组间差异无显著性（P>0.05）;3. 采用不同培养基的各组 DC 在体外均能有效地激发同种异体外周血 T 细胞的增殖。不同组间差异无显著性（P>0.05）;

论文目录

• 一、论文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 实验一有血清和无血清体外培养树突状细胞及激发同种异体外周血T 细胞增殖的比较研究
• （五） 实验二 DC 递呈抗原激活CTL 诱导抗肿瘤免疫反应的比较研究
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• （九） 附图
• 二、文献综述
• （一） 正文
• （二） 参考文献
• 三、致谢