香蕉苹果酸脱氢酶基因克隆及表达分析

论文摘要

苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase, MDH）普遍存在于动物,植物,细菌各种生物体中,具有高度的保守性,催化苹果酸和草酰乙酸的相互转化。根据辅酶特异性,MDH可分为NAD依赖的MDHs（NAD-MDHs）和NADP依赖的MDHs（NADP-MDHs）。MDH不仅参与众多生理活动,包括C4循环,呼吸作用,脂肪酸的氧化,TCA循环等,而且在种子萌发,植物生长,花粉发育,果实发育,植物抗逆等方面发挥重要作用。本研究选取实验室已构建的香蕉果实cDNA文库中的一个片段,采用RACE技术从香蕉果实cDNA文库中克隆到其全长cDNA,经序列测定和同源性分析表明,该cDNA全长为1249bp,包含一个完整的999bp的开放阅读框,编码332个氨基酸,与苹果酸脱氢酶基因同源性很高,命名为MaMDH。保守结构域分析发现MaMDH具有NAD结合位点,苹果酸结合位点,二聚体结合位点。氨基酸序列比对发现,该基因编码的氨基酸与蓖麻,烟草,桃树和回回豆的氨基酸同源性很高,都在90%以上。进化树分析表明,MaMDH基因与小麦,玉米的进化距离较近。用real-time RT-PCR对MaMDH基因在香蕉不同器官的表达进行分析发现,MaMDH基因在各器官中均表达,其中在花中表达量最高,其次在根和果实中表达量较高,在茎、叶中表达量较低,推测MaMDH可能在许多不同的生理过程中都起着一定的作用。在香蕉果实自然成熟过程中,研究了MaMDH基因的表达,酶活及苹果酸之间的关系。结果表明,MaMDH的转录水平受果实发育调节,随着果实的成熟表达逐渐上升,在采后14d趋于稳定。MaMDH的酶活随着果实的成熟逐渐增强,与其表达水平呈正相关。苹果酸含量在果实发育早期逐渐增加,在成熟阶段又呈下降趋势。随着果实的成熟,可溶性总糖含量也逐渐上升。为了研究MaMDH与香蕉果实采后乙烯生物合成的关系,在正常成熟,外源乙烯和乙烯抑制剂1-MCP处理果实的条件下,测定了香蕉果实采后不同时期的乙烯释放量,并用荧光定量PCR的方法研究了MaMDH在香蕉果实采后不同成熟阶段的表达情况。结果表明,正常成熟时,MaMDH基因的表达在采后14d达到高峰与乙烯峰相一致；在外源乙烯处理下,MaMDH基因的表达在采后3d达到高峰,此时也是乙烯高峰；用1-MCP处理后,MaMDH基因的表达明显受到抑制。以上结果说明,乙烯诱导了MaMDH基因在香蕉果实中的表达。用外源ABA和ABA生物合成抑制剂Fluridone分别处理香蕉果实,结果表明,ABA和Fluridone对MaMDH基因在香蕉果实中的表达有抑制作用。为了研究MaMDH基因对非生物胁迫的应答情况,对香蕉苗进行了干旱、低温、伤害、盐、A13+和乙烯利等多种胁迫处理。结果表明,在干旱和伤害胁迫下,MaMDH基因下调表达；在低温胁迫下,该基因在5°时表达量最高；在盐胁迫下,MaMDH基因在4h时表达量最高；在A13+胁迫下,MaMDH基因在12h表达量最高；在乙烯利处理下,MaMDH基因呈上调表达。用尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）侵染香蕉幼苗根部,检测MaMDH基因的表达情况,结果表明,MaMDH基因的表达受FOC4的诱导,在接种4d时表达量最大。

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摘要

Abstract

1 前言

1.1 香蕉概述

1.1.1 香蕉的经济价值

1.1.2 香蕉果实采后成熟过程对香蕉品质的影响

1.1.3 香蕉果实采后成熟的分子生物学研究进展

1.1.4 香蕉生长对环境的要求及挖掘抗逆基因的必要性

1.2 苹果酸脱氢酶（MDH）基因的研究进展

1.2.1 植物MDH概述

1.2.2 MDH在物质和能量代谢中的研究

1.2.3 MDH在植物发育中的研究

1.2.4 MDH与非生物胁迫的研究

1.2.5 细胞质型苹果酸脱氢酶（cyMDH）研究进展

1.3 研究内容

1.4 研究目的和意义

1.5 技术路线

2 材料、试剂与仪器

2.1 材料

2.2 试剂

2.3 仪器

3 方法

3.1 采后香蕉果实处理

3.2 香蕉苗逆境胁迫处理

3.2.1 干旱胁迫处理

3.2.2 冷害胁迫处理

3.2.3 伤害胁迫处理

3.2.4 盐渍胁迫

3.2.5 铝离子胁迫

3.2.6 乙烯利处理

3.3 尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）侵染香蕉苗

3.4 香蕉果实采后生理指标的测定

3.4.1 香蕉果实采后乙烯释放量的测定

3.4.2 香蕉果实采后成熟度的划分

3.4.3 细胞质总酶的提取及MaMDH酶活性的测定

3.4.4 香蕉果实采后苹果酸的测定

3.4.5 香蕉果实采后可溶性总糖的测定

3.5 香蕉不同器官,果实不同处理及香蕉苗总RNA提取

3.6 cDNA第一链的合成

3.7 MaMDH基因的克隆

3.7.1 从香蕉果实cDNA文库中克隆MaMDH基因5’端

3.7.1.1 引物设计

3.7.1.2 PCR反应体系和程序

3.7.1.3 目的片段回收

3.7.1.4 回收产物与pMD19-T vector连接

3.7.1.5 E.coli DH5α感受态细胞的制备

3.7.1.6 连接产物转化E.coli DH5α

3.7.1.7 重组质粒DNA的小量提取

3.7.1.8 重组质粒的PCR和酶切鉴定及测序

3.7.2 MaMDH cDNA全长克隆

3.7.2.1 引物设计

3.7.2.2 PCR反应体系和反应程序

3.7.2.3 PCR产物回收、连接、转化及质粒提取鉴定

3.8 生物信息学分析

3.9 荧光定量RT-PCR分析MaMDH基因

3.9.1 eDNA第一链的合成

3.9.2 荧光定量PCR的引物设计

3.9.3 荧光定量PCR的反应体系和反应程序

3.9.4 荧光定量PCR的定量方法

4 结果

4.1 MaMDH基因的克隆

4.1.1 MaMDH基因5′端序列的克隆

4.1.2 MaMDH cDNA全长克隆

4.2 MaMDH的序列分析

4.2.1 生物信息学分析

4.2.2 MaMDH的进化树分析

4.3 MaMDH基因在香蕉各器官的差异表达

4.4 MaMDH基因在香蕉果实采后不同时期的表达分析

4.4.1 香蕉果实采后成熟过程中乙烯释放速率的测定

4.4.2 MaMDH基因在香蕉果实采后成熟过程中的表达分析

4.4.3 MaMDH在香蕉果实采后正常成熟过程中的酶活性测定

4.4.4 香蕉果实采后正常成熟过程苹果酸含量的测定

4.4.5 香蕉果实采后正常成熟过程可溶性总糖的测定

4.5 MaMDH基因对非生物胁迫的应答

4.5.1 MaMDH基因在香蕉苗干旱胁迫下的差异表达

4.5.2 MaMDH基因在香蕉苗低温胁迫下的差异表达

4.5.3 MaMDH基因在香蕉苗伤害胁迫下的差异表达及酶活性

4.5.4 MaMDH基因在香蕉苗盐胁迫下的差异表达

3+胁迫下的差异表达'>4.5.5 MaMDH基因在香蕉苗Al³⁺胁迫下的差异表达

4.5.6 MaMDH基因在香蕉苗乙烯利处理下的差异表达

4.6 MaMDH基因在香蕉苗FOC4侵染下的差异表达

5 讨论

5.1 MaMDH基因的克隆与序列分析

5.2 MaMDH基因器官差异性表达分析

5.3 MaMDH基因在香蕉果实采后成熟过程中的表达分析

5.4 MaMDH基因与逆境胁迫的关系

5.4.1 MaMDH基因与干旱胁迫,盐胁迫,低温胁迫的关系

5.4.2 MaMDH基因与伤害胁迫的关系

3+胁迫的关系'>5.4.3 MaMDH基因与Al³⁺胁迫的关系

5.4.4 MaMDH基因与乙烯利胁迫的关系

5.4.5 MaMDH基因与枯萎病菌（FOC4）的关系

6 结论

参考文献

致谢

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