食品添加剂亚硫酸钠的肝损伤机制研究

论文摘要

目的:文献报道和前期体内试验发现亚硫酸盐可能引起肝细胞脂肪变性和甘油三酯含量增加,本次试验拟通过体外实验证实亚硫酸钠对肝脏的损伤作用并探讨其引起肝细胞脂肪沉积的可能机制,为进一步研究食品添加剂亚硫酸盐的健康危害提供可靠的理论基础,并为食品中亚硫酸盐应用限量标准的修定提供一定的科学依据。方法:将正常人二倍体肝细胞株HL-7702（简称L-02）培养于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中,分别以不同浓度的亚硫酸钠（Na2SO3）作用于HL-7702细胞,其终浓度分别为0mmol/L、0.039mmol/L、0.156mmol/L、0.625mmol/L、2.5mmol/L,并设阳性对照组（乙醇,3%）。用倒置显微镜观察细胞形态学变化;采用MTT法观察亚硫酸钠对肝细胞活力的影响;采用生化分析法检测不同接触时间后各染毒组肝细胞培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）的活性和白蛋白、总蛋白的含量;采用酶比色法测定细胞内甘油三酯（TG）的水平;应用免疫细胞化学方法检测HL-7702肝细胞中与甘油三酯代谢密切相关的载脂蛋白B100（apo-B100）和载脂蛋白E（apo-E）的表达情况。结果:1、亚硫酸钠对肝细胞形态结构的影响:据倒置显微镜观察发现,Na2SO3染毒24h后,对照组L-02肝细胞呈多边形,单层排列,无重叠生长,细胞界限清晰,细胞贴壁良好;0.039mmol/L染毒组与对照组相比,细胞形态无明显变化;0.156mmol/L染毒组出现少量漂浮的圆形细胞,但仍可见大量正常形态细胞;0.625mmol/L染毒组圆形细胞数目增多;2.5mmol/L染毒组细胞的形态却明显异常,呈单个细胞贴壁,细胞数量减少、体积减小、许多细胞贴壁能力下降而呈漂浮状态、死细胞增加及细胞间隙增大等。2、亚硫酸钠对L-02肝细胞活性的影响:据MTT比色法的检测结果可见,当接触染毒24h后,随着Na2SO3浓度的增加,细胞活性抑制率逐渐升高,存在剂量-反应关系（r=0.813,P<0.01）。其中0.625mmol/L和2.5mmol/L Na2SO3染毒组与对照组相比,差异具有统计学意义（p<0.05）,说明Na2SO3在一定范围内具有抑制肝细胞活性的能力。3、亚硫酸钠对肝细胞培养上清中LDH的影响:将肝细胞分别染毒24h、48h和72h后,随着Na2SO3染毒浓度的增加,各染毒组肝细胞上清中LDH的活性逐渐升高,并存在明显的剂量-反应关系（r24=0.841,p<0.01;r48=0.916,p<0.01;r72=0.619,p<0.01）;说明Na2SO3可能对肝细胞膜的通透性有一定影响。4、亚硫酸钠对肝细胞培养上清中AST活性的影响:1)在Na2SO3染毒后24h,随着染毒浓度的增加,各染毒组肝细胞培养上清中AST的活性逐渐升高,其中0.625mmol/L组和2.5mmol/L组与阴性对照组比较有显著性差异（p<0.05或p<0.01）,并存在剂量-反应关系（r24=0.652,p<0.01）。而在染毒48h和72h,各染毒组与对照组比较无统计学意义;2)在相同浓度的Na2SO3作用下,随着作用时间的延长,肝细胞培养上清中AST的活性有逐渐降低的趋势,48h和72h时间组与24h时间组比较有统计学意义（p<0.05或p<0.01）。5、亚硫酸钠对肝细胞培养上清中ALT活性的影响:当作用时间为24h、48h时,随着Na2SO3染毒浓度的增加,肝细胞培养上清中ALT的活性逐渐升高,与对照组比较统计学意义（p<0.05或p<0.01）;其中染毒24h存在剂量-反应关系（r24=0.873,p<0.01）。而在染毒72h后,各染毒组与对照组之间的ALT不再具有显著性差异。以上4、5观察结果提示亚硫酸钠对肝细胞的严重损伤作用主要表现在接触早期。6、亚硫酸钠对肝细胞白蛋白和总蛋白合成的影响:在相同的作用时间条件下,随着Na2SO3染毒浓度的增加,肝细胞培养上清中白蛋白和总蛋白的含量与阴性对照组比较无统计学意义（p>0.05）;说明Na2SO3对肝细胞的白蛋白和总蛋白合成能力无明显影响。7、亚硫酸钠对肝细胞内TG水平的影响:当Na2SO3作用时间为24h和48h时,各染毒组HL-7702细胞内TG含量无显著性差异（p>0.05）;在染毒后72h,0.625mmol/L组TG水平增加,与阴性对照组比较有统计学意义。8、亚硫酸钠对肝细胞apo-B100和apo-E表达的影响:根据免疫细胞化学检测结果:Na2SO3接触24h、48h和72h后,各染毒组肝细胞内apo-B100蛋白表达无明显改变。Na2SO3作用72h后,2.5mmol/L组的apo-E蛋白表达水平明显降低,与阴性对照组比较有统计学意义（p<0.05）。提示亚硫酸钠在一定剂量条件下可能对肝细胞中apo-E的含量有影响。结论:1、Na2SO3在一定条件下对HL-7702肝细胞活性存在一定的抑制作用。2、Na2SO3在一定条件下可使肝细胞培养上清中LDH、AST、ALT的活性升高,提示其对肝细胞膜可能有一定的损伤作用,并可能导致肝细胞死亡。3、在一定剂量条件下,亚硫酸钠可能引起肝细胞内甘油三酯含量增加,也可能对肝细胞内apo-E水平有一定影响,但对白蛋白和总蛋白水平无明显影响。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文缩写词对照表
• 前言
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 四、结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 个人简历
• 致谢