二甲双胍对成骨细胞及去卵巢大鼠OPG/RANKL表达的影响

论文摘要

背景：糖尿病是21世纪最严重,最具挑战性的疾病之一,影响了世界上数百万人。最近,糖尿病与骨质疏松性骨折的关系越来越被人重视。大量临床试验报道证实骨质疏松是糖尿病的慢性并发症之一。正因1型糖尿病及2型糖尿病患者所引起的骨折风险比非糖尿病大,并且糖尿病及骨质疏松均主要作用于中老年患者,给患者带来沉重的经济负担。因此,如何防止糖尿病所致的骨折是目前迫不及待的一项重要任务。二甲双胍是目前国外唯一应用并被FDA认可的双胍类降糖药,在临床中有着广泛的应用。近来,一项回顾性研究结果表明二甲双胍能减少1型和2型糖尿病患者骨折的发生率。Cortizo等研究发现二甲双胍可以诱导成骨样细胞系（UMR106, MC3T3）的生长和分化,同时具有增加细胞外基质矿化的能力。正因二甲双胍能减少骨折的发生率并对成骨细胞起着积极地作用,这表明二甲双胍能明显的减少骨丢失。但是二甲双胍如何减少骨丢失的机制是复杂的,而且目前其机制并不清楚,对于二甲双胍对破骨细胞的影响至今仍未报道。骨组织的稳定主要是由于骨吸收及骨形成的相互平衡。起骨吸收作用的主要细胞是破骨细胞。很早以前就有报道,破骨细胞主要来源于单核巨噬细胞系统,由单核细胞融合分化而成。其分化和成熟主要靠集落刺激因子（M-CSF）,护骨素（OPG）及护骨素配体（RANKL）。成骨细胞分泌的两种细胞因子对骨重建起着重要的作用,这两种细胞因子就是OPG及RANKL[13,13]。OPG及RANKL有调节破骨细胞的作用,RANKL通过与表达于破骨细胞的细胞核因子-κ3受体活化因子（RANK）结合,能够刺激破骨细胞活化和增殖；OPG与RANK竞争结合RANKL,从而抑制骨吸收,防止骨质疏松的发生[14,15]。因此,RANKL/RANK/OPG轴的失衡是导致很多溶骨性骨异常吸收疾病的主要原因。目的：综上所述,二甲双胍和OPG/RANKL比率在骨修复重建中都起着重要的作用。但二甲双胍能对成骨细胞OPG及RANKL分泌的影响及分子机制尚未见报道。本文通过细胞与动物模型,探讨了二甲双胍对成骨细胞及去卵巢大鼠OPG/RANKL表达的影响,为二甲双胍临床防治糖尿病性骨质疏松症的合理用药提供科学的实验依据。方法：本研究旨在通过分子、细胞及整体水平深入探讨二甲双胍依赖OPG/RANKL/RANK系统调节破骨细胞的生成及其相关的作用机制的初步研究。用RT-PCR, ELISA和Western blotting等生物学技术,从基因及蛋白表达水平,研究在二甲双胍诱导下成骨细胞OPG/RANKL表达变化情况,阐明其相应的分子生物学基础,并对其相关的分子作用机制进行初步探讨以及应用成骨细胞与破骨细胞前体（Raw264.7细胞）共培养模型进一步验证以上结论。同时,对去卵巢诱导骨质疏松大鼠给予二甲双胍干预下,检测OPG/RANKL的表达并运用骨密度、骨组织形态计量学、破骨细胞染色计数等手段来综合评价二甲双胍对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用。结果：1、二甲双胍对成骨细胞OPG/RANKL mRNA和蛋白表达的影响A、二甲双胍对头盖骨成骨细胞及MC3T3-E1呈浓度及时间依赖性增加OPGmRNA水平的表达。RT-PCR结果显示：与对照组相比,不同浓度二甲双胍（200-800μmol/L）分别作用于成骨细胞48h,均可呈剂量依赖性促进头盖骨成骨细胞OPG mRNA的表达（P<0.05）。200μmol/L时约为对照组表达量的1.31倍,具有统计学显著性差异（P<0.05）,400或800μmol/L时约为对照组表达量的1.63及1.75倍,差异具有统计学意义（P<0.05）,这结果与阳性对照雌激素结果相似。同时,400μmol/L二甲双胍干预成骨细胞24-72h后发现二甲双胍呈时间依赖性促进OPG mRNA的表达,差异均有显著意义（P<0.05）.400μmol/L二甲双胍作用于成骨细胞72h促进作用最明显,约为对照组表达水平的2.03倍,有显著性差异（P=0.000）。B、二甲双胍对成骨细胞OPG上调的机制可能与AMPK通路有关ELISA结果显示：随着二甲双胍浓度的增加,OPG表达水平呈剂量依赖性增高。各种不同药物浓度（50-800μmol/L）作用头盖骨成骨细胞48h后OPG蛋白表达差异均有显著意义（P<0.001）,50μmol/L时OPG蛋白的表达即开始升高,200-800μmol/L时OPG增加比较明显（P< 0.001）,800μmol/L时OPG蛋白的表达最高。为明确二甲双胍上调成骨细胞OPG的作用机制,本研究使用了各种不同抑制剂。结果示AMPK以及CaMKK特异抑制剂compound C和STO-609,而非MEK1、p38、NF-кB特异抑制剂PD9805、SB203580、Bay-117028降低二甲双胍对成骨细胞OPG上调作用。C、二甲双胍减少成骨细胞RANKL mRNA和蛋白的表达。本研究发现二甲双胍呈剂量依赖性减少头盖骨成骨细胞RANKL mRNA水平的表达。Western blot结果同样示二甲双胍呈剂量依赖性减少RANKL表达。D、二甲双胍能抑制破骨细胞分化。本研究使用二甲双胍与维生素D3共同作用成骨细胞的上清液诱导Raw264.7细胞分化并进行TRAP染色计数。结果示随着二甲双胍浓度的增加,破骨细胞呈剂量依赖性减少。为明确破骨细胞的存在,本研究进一步行RT-PCR检测破骨细胞特异基因TRAP和cathepsin K表达,结果示上述基因表达随时间的增加而增加。由此可知,二甲双胍是通过调节成骨细胞细胞因子的分泌而抑制破骨细胞分化。2、二甲双胍对去卵巢大鼠OPG/RANKL表达的影响及对骨质疏松防治作用的实验研究A、动物实验中证实,二甲双胍能上调去卵巢大鼠OPG、下调RANKL表达的影响。ELISA结果示二甲双胍能增加去卵巢大鼠血清OPG的表达；Western blot结果示二甲双胍能下调去卵巢大鼠骨髓组织中RANKL的表达。B、二甲双胍能抑制破骨细胞形成及骨丢失。骨密度检测：三组大鼠间股骨的骨密度均有差异（P<0.001）。OVX组低于Sham组（P<0.001）,而OVX+Met组明显高于OVX组（P<0.001）。Von Kossa及TRAP染色：Von Kossa染色示OVX+Met组的矿化结节明显多于OVX组,二甲双胍能防止OVX的骨丢失。TRAP染色示OVX组破骨细胞数约为Sham组的8.]5倍,但二甲双胍能明显减少OVX组的破骨细胞数。结论：通过细胞与动物实验证明,二甲双胍能上调成骨细胞OPG及下调RANKL的表达,进而抑制破骨细胞的分化,减少骨丢失,防止骨质疏松。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 二甲双胍对成骨细胞OPG/RANKL表达的影响
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第二部分 二甲双胍对去卵巢大鼠OPG/RANKL表达的影响及对骨质疏松防治作用的实验研究
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 全文主要结论
• References
• 附录
• 成果
• 致谢
• 统计学审稿证明