灰色链霉菌RX-17产β-1，4-N，6-O-二乙酰胞壁质酶基因的克隆、表达和耐酸性分子改造

论文摘要

在添加了变形链球菌的双层平板上,筛选到一株高产溶菌酶的灰色链霉菌（Streptomyces griseus）RX-17,经过CM Sepharose Fast Flow离子交换层析以后得到两个β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶组分,通过GenBank数据库中已知的由球孢链霉菌所产生的β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶M1序列进行比对,找出同该酶同源性最高的50个序列,而后对这50个序列进行比对,找出β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶最保守的两个短氨基酸序列,同时根据链霉菌基因组碱基构成的特点使用互联网引物设计程序设计了CODEHOP（Consensus-Degenerate HybridOligonucleotide Primers）引物,并成功克隆出了β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2保守区基因序列,进而通过TAIL PCR扩增出了全长基因序列。对β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2在大肠杆菌中进行了表达,分别使用了pET-28a（+）、pBV220、pGEX-4T-1、pMAL-c2E以及pET-26b（+）等表达质粒,以及BL21（DE3）pLysS、Rosetta（DE3）、Rosetta-gamiTM（DE3）等宿主菌,结果表明,在pET-28a（+）、pBV220中进行表达,无论使用哪种宿主菌,通过任何方法都无法检测到生物活性亦无法通过SDS-PAGE检测到明显的蛋白条带,这说明目的蛋白没有表达,可能是由于β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶本身对于大肠杆菌是一种毒性蛋白,因此抑制了酶的表达。使用pGEX-4T-1进行融合表达,通过SDS-PAGE发现能够得到大量的表达,然而表达产物以错误折叠无生物活性的包涵体形式存在于细胞内,仅有少量可溶性表达,将可溶性部分通过GST Bind Resin进行分离纯化,并经过凝血酶切割,仍然无法得到具有生物活性的表达产物,这可能是因为可溶性表达的蛋白量过少或者蛋白是错误折叠的无活性分子。使用pMAL-c2E融合表达载体成功表达出可溶性的β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶,经过Amylose Resin纯化并用肠激酶切除融合标签以后能够得到具有生物活性的酶蛋白。通过测定发现重组酶R2最适作用pH同由灰色链霉菌所产的野生型β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2相同,均为7.0左右,最适作用温度约为50℃,较野生型β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2低,然而在37℃的酶活却比野生型酶有明显提高。使用pET-26b（+）质粒在BL21（DE3）pLysS能得到少量在周质空间表达的有生物活性的酶蛋白,但是通过SDS-PAGE和比浊法都无法检测到酶活,仅能通过诱导表达后大肠杆菌宿主菌发生自身降解以及琼脂平板扩散法检测到活性,这可以作为后续突变中的筛选方法。由于β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶具有水解变形链球菌的能力,同时对于龋齿的防治具有较好的效果,因此具有潜在的应用价值。然而口腔中的微酸性环境却不利于酶作用的充分发挥,为了能够提高酶分子在微酸性条件下的活性,需要对酶进行耐酸性的改造。根据已知的天蓝色链霉菌所产的Cellosyl的晶体结构,确定了酶的活性中心位于9-Asp、98-Asp和100-Glu,因此选取了在空间结构中靠近活性中心氨基酸同时又不参与任何底物结合于催化反应的183-Gln作为定点突变的对象,突变的结果表明将其突变为Glu,最适作用pH发生了酸移,而将其突变为Ala,最适作用pH未发生改变,将其突变为Lys以后,酶活完全丧失。另外由于62-Tyr和138-Tyr同样位于活性中心区域附近,同时保守性较高,因此又对酶的138-Tyr和62-Tyr再加上183-Gln进行了三点饱和突变,结果表明在选取的200个饱和突变体中大多数酶活丧失,在酶活仍存留的突变体中仅有5个发生了最适作用pH酸移,大部分最适pH没有发生改变。经过测序表明,62位Tyr和138位Tyr的突变对于改变酶的最适作用pH方面没有太大影响,Tyr突变为多种氨基酸仅对酶的空间结构发生了影响,而183位Gln的突变则影响了酶的最适作用pH,在获得的5个最适作用pH酸移的突变体中有4个Gln均突变为酸性氨基酸,还有一个突变为Ser,同定点突变的结果是一致的。这说明突变后的酸性氨基酸能够提供质子,从而影响活性中心区域氨基酸的解离,使得酶的活性中心氨基酸pKa值发生改变,最终导致最适作用pH发生变化。对灰色链霉菌RX-17基因组中另一个β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶组分R5也进行了克隆。在已经得到的CODEHOP引物5’末端添加抑制序列的方法设计出同源抑制PCR的引物HRPP（Homologous restraint PCR primer）,并进行了同源抑制PCR扩增出了其保守区域,进而通过TAIL PCR得到其基因全长。R5基因全长825bp,经过比对,R2基因同R5基因同源性为79%,R5基因翻译成的蛋白序列经过SignalP服务器分析为典型分泌型蛋白。通过构建的进化树分析表明,R2和R5两种酶蛋白的亲缘性较远,同一个菌株所产的同一种类型的酶却有着较大的差距。按照信号肽预测软件的结果,对β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R5的成熟肽基因使用pMAL-c2E进行了表达,最终得到具有活性的表达产物。重组β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R5的最适作用pH为7.0,最适作用温度为70℃。

论文目录

• 中文目录
• INDEX
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶的研究背景
• 1.1.1、链霉菌产β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶的研究历史
• 1.1.2、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶分子生物学研究
• 1.1.3、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶的三维结构研究
• 1.2、蛋白质工程技术在改变酶的最适作用pH中的应用
• 1.3、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶对龋齿的作用
• 1.4、本论文立题依据及主要内容
• 第二章 β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2基因的克隆
• 2.1、材料与方法
• 2.1.1、材料
• 2.1.2、方法
• 2.2、结果与讨论
• 2.2.1、CODEHOP引物的设计
• 2.2.2、CODEHOP PCR
• 2.2.3、保守区序列的克隆、鉴定及测序
• 2.2.4、TAIL PCR
• 2.2.5、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2全序列及其序列分析
• 2.3、小结
• 第三章 β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2在大肠杆菌中的表达
• 3.1、材料与方法
• 3.1.1、材料
• 3.1.2、方法
• 3.2、结果与讨论
• 3.2.1、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2基因的扩增
• 3.2.2、采用pET-28a（+）表达质粒表达β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2
• 3.2.3、采用pBV220表达质粒表达β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2
• 3.2.4、采用pGEX-4T-1表达质粒表达β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2
• 3.2.5、采用pMAL-c2E表达质粒表达β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2
• 3.2.6、采用pET-26b（+）表达质粒表达β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2
• 3.3、小结
• 第四章 β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2的耐酸性分子改造
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1、材料
• 4.1.2、方法
• 4.2、结果与讨论
• 4.2.1、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2定点突变
• 4.2.2、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2三点饱和突变
• 4.2.3、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R2的立体结构模型构建
• 4.3、小结
• 第五章 β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R5基因的克隆与表达
• 5.1、材料与方法
• 5.1.1、材料
• 5.1.2、方法
• 5.2、结果与讨论
• 5.2.1、同源抑制PCR引物的设计
• 5.2.2、同源抑制PCR
• 5.2.3、保守区序列的克隆、鉴定及测序
• 5.2.4、TAIL PCR
• 5.2.5、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R5全序列及其序列分析
• 5.2.6、β-1,4-N,6-O-二乙酰胞壁质酶R5在大肠杆菌中的表达
• 5.3、小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表和已被录用的论文
• 外文论文
• 学位论文评阅及答辩情况表