利用基因敲除研究小鼠Dapper2基因的功能

论文摘要

Dapper（Dpr）家族成员在胚胎发育过程中发挥着重要的功能,并且参与了多种信号通路的调节,主要包括TGF-β/Nodal,经典和非经典的Wnt信号通路。目前,在小鼠中已发现三种Dpr家族成员,Dpr1-Dpr3。通过对他们时空表达谱的研究发现,三种Dpr均在胚胎的各时期表达,在成年组织的表达略有差异,但是在脑中的表达量都比较高。已有研究发现斑马鱼Dpr2通过促进Nodal/TGF-β的I型受体经溶酶体途径降解来调节其信号通路,体内功能实验证明斑马鱼Dpr2抑制Nodal信号的中胚层诱导活性。虽然小鼠Dpr2在体外能够抑制TGF-β信号,并且在斑马鱼胚胎中过表达也能减少一些中胚层特异基因的表达,但是关于小鼠Dpr2体内功能的研究还没有报道。在本研究中,通过基因打靶技术制备了Dpr2基因完全敲除小鼠（Dpr2-/-）。但是却发现Dpr2-/-小鼠胚胎发育正常,并没有出现胚胎致死的表型。Dpr2-/-小鼠的囊胚同野生型的一样,可以从透明带中孵出并且拥有正常的Outgrowth。出生后的Dpr2-/-小鼠能够正常生长,雌雄均可育。对Dpr2-/-小鼠脑进行组织学分析没有发现任何异常,其神经干细胞的增殖同野生型小鼠也没有差别。本研究还发现Dpr2在成年小鼠的表皮及毛囊角质细胞中高表达,并且缺失Dpr2导致小鼠皮肤创伤愈合的再表皮化加快。进一步的研究证实,缺失Dpr2增强了角质细胞对TGF-β信号的反应性,并且TGF-β信号通过上调特定的integrin基因的表达来促进角质细胞的迁移。由此可以得出如下结论:缺失Dpr2基因对于小鼠胚胎发育、生长和脑的形态没有影响,Dpr2通过抑制TGF-β信号来抑制创伤皮肤的再表皮化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 小鼠胚胎发育的基本过程
• 1.1.1 小鼠植入前胚胎发育
• 1.1.2 小鼠胚胎植入后发育及器官发生
• 1.2 几种信号通路及其在小鼠胚胎发育中的重要作用
• 1.2.1 TGF-β信号通路
• 1.2.2 Nodal 信号通路
• 1.2.3 Wnt 信号通路
• 1.3 基因敲除
• 1.3.1 基因敲除的概念及发展现状
• 1.3.2 完全基因敲除的策略
• 1.3.3 条件基因敲除的策略
• 1.4 皮肤创伤愈合
• 1.4.1 皮肤创伤愈合的研究意义
• 1.4.2 皮肤创伤愈合的研究现状
• 1.4.3 TGF-β1 在皮肤创伤愈合中的作用
• 1.5 Dpr 蛋白家族及其主要功能
• 1.5.1 Dpr 的发现
• 1.5.2 Dpr 蛋白的结构域特征
• 1.5.3 Dpr 的已知功能
• 1.6 本课题研究的内容及目的
• 第2章 材料与方法
• 2.1 ES 细胞系与实验动物
• 2.2 基因打靶载体的构建
• 2.3 滋养层细胞的制备
• 2.4 ES 细胞的培养与传代
• 2.5 电击法转染ES 细胞
• 2.6 阳性ES 克隆的挑取
• 2.7 ES 克隆的于96-孔板中的冻存
• 2.8 ES 克隆基因组DNA 的制备
• 2.9 Southern 杂交法筛选中靶ES 细胞
• 2.10 小鼠供体囊胚的制备、囊胚的显微注射、胚胎移植
• 2.11 PCR 鉴定小鼠基因型
• 2.12 小鼠囊胚分离及其培养
• 2.13 囊胚及其Outgrowth 的免疫荧光
• 2.14 RT-PCR
• 2.15 Northern Blot
• 2.16 苏木精－伊红染色（H& E）
• 2.17 组织原位杂交
• 2.18 皮肤创伤愈合实验
• 2.19 组织免疫组化
• 2.20 小鼠皮肤角质细胞（Keratinocyte）的分离
• 2.21 报告基因检测实验
• 2.22 免疫印迹（Western blot）
• 2.23 体外创伤愈合实验
• 2.24 Transwell 实验
• 2.25 Real-time PCR 实验
• 2.26 Morris 水迷宫
• 第3章 小鼠Dpr2 基因及其表达谱
• 3.1 小鼠Dpr2 基因及其编码蛋白质的特征
• 3.2 小鼠Dpr2 基因的时空表达分析
• 3.2.1 Dpr2 基因在小鼠胚胎期及成年组织中的表达
• 3.2.2 Dpr2 基因在成年小鼠脑中的表达
• 3.3 讨论
• 第4章 Dpr2 基因完全敲除小鼠的建立与鉴定
• 4.1 同源序列的克隆
• 4.1.1 克隆同源序列
• 4.1.2 Southern 印迹杂交探针的测试
• 4.2 Dpr2 基因打靶载体的构建
• 4.3 中靶胚胎干细胞的筛选
• 4.3.1 打靶载体电转ES 细胞
• 4.3.2 中靶ES 细胞的鉴定
• 4.4 Dpr2 基因完全敲除小鼠的获得
• 4.4.1 通过显微注射或者首建小鼠
• 4.4.2 Dpr2 基因敲除小鼠的鉴定
• 4.4.3 删除中靶等位基因中的Neo 基因
• 4.5 讨论
• 第5章 Dpr2 基因敲除小鼠胚胎的发育生长
• 5.1 Dpr2 基因敲除小鼠的大体表型分析
• 5.2 缺失Dpr2 之后小鼠囊胚增殖和发育正常
• 5.3 讨论
• 第6章 Dpr2 基因敲除小鼠的脑形态和功能
• 6.1 Dpr2 基因敲除小鼠的各个脑区形态正常
• 6.2 缺失Dpr2 基因对小鼠脑神经干细胞增殖没有影响
• 6.3 缺失Dpr2 基因后Dpr1 和Dpr3 的表达没有被上调
• 6.4 Dpr2 基因敲除小鼠的空间记忆能力有轻微下降
• 6.5 讨论
• 第7章 缺失Dpr2 小鼠皮肤创伤愈合再表皮化速度加快
• 7.1 缺失Dpr2 小鼠皮肤创伤愈合速度加快、角质细胞迁移增强
• 7.2 缺失Dpr2 增强细胞对TGF-β1 信号的反应性
• 7.3 TGF-β1 信号增强加速了Dpr2 -/-角质细胞的迁移
• 7.4 在Dpr2 基因敲除小鼠角质细胞中integrins 的表达上调
• 7.5 讨论
• 第8章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果