论文摘要
研究背景及目的脓毒症（sepsis）是感染、严重创伤及大手术等多种应激状态时的常见并发症。近年随着滥用抗生素使耐药菌增多,介入性治疗及有创性监护增多,以及医院内感染的增多等因素,脓毒症死亡率居高不下,约28%～50%,合并休克及脏器功能不全时可达50%～70%,甚至很快死亡。儿科严重脓毒症和脓毒性休克（septic shock）至今仍处于高发病率、高病死率状态。2002年,国际儿科脓毒症共识会议专家组按严格科学的程序,首次在儿科界确定了脓毒症的相关概念[包括儿科全身炎症反应综合征、感染、脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克和多器官功能障碍综合征（MODS）]。经3年实践,2005年1月发表。严重脓毒症由于病死率高（是美国儿童患病及死亡的主要原因之一）、治疗费用昂贵,已构成对人类健康的严重威胁和经济发展的巨大负担。革兰阴性菌（G-）感染是引起脓毒症的重要原因之一,其外膜的活性成分内毒素即脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）与宿主细胞膜上的模式识别受体模式识别受体TLR2和TLR4（toll-like receptor,TLR）结合,启动一系列信号传导反应,引起多种细胞因子和炎症介质的表达和释放。众多实验研究证实前炎症细胞因子TNF-α（tumor necrosis factor-α）是脓毒症和脓毒性休克发病的重要介质,巨噬细胞是脓毒症TNF-α产生的主要来源。大量TNF-α的产生可引起多种细胞因子和炎症介质的过度表达和释放,诱发全身炎性反应,导致血管通透性增加、体液渗出和淋巴细胞移行到炎症部位,影响到心血管、呼吸、血液等多系统的功能。其中,肺是最普遍受影响的器官,脓毒症病人经常发展为急性肺损伤（acute lung injury,ALI）或者急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome,ARDS）。肺功能损伤使脓毒症病人必然伴随低氧的病理状态。低氧、低糖、高水平的炎症细胞因子和活性氧代谢产物等是炎症和损伤组织微环境的特点。缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor 1,HIF-1）是哺乳动物和人体内细胞存在着一类介导低氧适应性反应的转录因子,它的氧调节亚单位HIF-1α仅在低氧状态表达,能激活许多低氧反应性基因（hypoxia responsive genes,HRG）的表达。尽管低氧与脓毒症相关,对TNF-α的产生是否与脓毒症低氧过程及HIF-1α诱导相关,这些问题只有很少的研究。p38 MAPK（mitogen activated protein kinase）被认为是“应激诱导”的MAPK,可在转录和转录后水平调控TNF-α表达,在LPS诱导的TNF-α信号传导通路中占据重要地位,抑制p38通路有希望成为炎症性疾病的新的治疗策略。以SB203580为代表的吡啶异咪哒唑化合物是p38 MAPK的特异性抑制剂,但是对其体内应用效果却仍然存在争议。对氧浓度是否参与p38激活的报道较少见。本研究通过培养小鼠巨噬细胞RAW264.7和腹腔巨噬细胞,观察在不同氧浓度状态下p38 MAPK的活性和TNF-α分泌水平的改变,同时应用p38抑制剂SB203580进行干预,证实低氧在TNF-α合成中的重要地位。在内毒素血症小鼠模型应用p38抑制剂SB203580治疗,观察小鼠血清TNF-α水平和肺组织HIF-1α蛋白的表达,阐明低氧和HIF-1α在调节脓毒症TNF-α产生的作用机制及其与p38 MAPK通路的关系。研究方法1.SB203580对小鼠巨噬细胞系TNF-α产生的抑制效应与低氧和p38 MAPK活性的关系（1）正常氧状态下SB203580抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞TNF-α产生的剂量关系实验RAW264.7细胞分别用25μM和10μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS10、100及1000 ng/ml,另外一组RAW264.7细胞分别用1-20μM SB203580预处理2h,然后加入LPS 1ng/ml或者用0.2-2μM SB203580预处理2 h,然后加入LPS 0.1ng/ml,正常氧状态下细胞继续孵育18 h,收集上清液。（2）SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-α产生的抑制效应实验RAW264.7细胞培养液加入10μM SB203580培养2 h后加入LPS 1 ng/ml,细胞分别在正常氧、低氧（0.5%O2）和氯化钴（100μM）模拟低氧环境孵育18 h,收集上清液。（3）SB203580在正常和低氧浓度环境下对TNF-αmRNA转录活性及mRNA稳定性的影响实验RAW264.7细胞处理同上,加入LPS培养2 h后,用Trizol方法提取细胞RNA。另设实验组在加入LPS 2 h后再加入2μg/ml转录抑制剂Actinomycin D,加入Actinomycin D的时间点为0时,在10、30和60 min时间点用Trizol收集细胞RNA。（4）正常和低氧浓度环境下SB203580抑制效应的动态监测实验RAW264.7细胞用10μM SB203580预处理2 h,在正常氧和氯化钴（100μM）模拟低氧环境下向细胞培养液中加入LPS 1ng/ml,加入LPS的时间点记为0时,在加入LPS后1、2、4、6、8h收集上清液。（5）低氧对p38 MAPK及其底物MAPKAPK2活性影响实验RAW264.7细胞经10μM SB203580预处理2 h后,在正常氧浓度和低氧模拟环境接受LPS 1ng/ml刺激,LPS加入的时间点记为0时,在10、30、60 min收集细胞蛋白质。2.低氧影响SB203580抑制小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α产生作用的实验向原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养液中加入20μM或10μM SB203580,2 h后加入LPS 1ng/ml或10 ng/ml,细胞在正常氧及氯化钴（100μM）模拟低氧环境下孵育18 h,收集上清液。以上细胞实验均设无SB203580预处理对照组和溶剂对照组。3.动物模型实验（1）正常氧环境下不同剂量LPS对小鼠血清TNF-α水平的影响小鼠接受腹腔注射0.5-3.5 mg/kg LPS 90 min后处死,留取标本。（2）正常氧环境和低氧环境下SB203580对内毒素血症小鼠血清TNF-α水平的影响小鼠接受静脉注射SB203580 15、25 mg/kg,2 h后腹腔注射LPS 0.5 mg/kg,将小鼠置于正常氧环境下或者低氧坏境（10%O2）,注射LPS后90 min处死小鼠,留取标本。（3）SB203580对内毒素血症小鼠血清TNF-α水平及肺HIF-1α表达的影响小鼠经静脉注射SB203580 15 mg/kg,2h后腹腔注射LPS 0.5 mg/kg,在注射LPS后90 min和240 min处死,留取血清和肺组织标本。以上动物实验均设溶剂对照组和生理盐水对照组,每组3只小鼠。3.实验标本处理方法（1）酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培上清液和小鼠血清TNF-α水平;（2）Real-time PCR定量检测TNF-αmRNA转录水平;（3）Western blot检测p38 MAPK活性和下游底物MAPKAPK2蛋白表达;（6）RT-PCR和Real-time PCR检测小鼠肺组织HIF-1αmRNA的表达;（7）Western blot检测小鼠肺组织HIF-1α蛋白的表达;（8）免疫组织化学染色（IHC）检测小鼠HIF-1α蛋白在肺组织中的表达及分布情况。研究结果1.正常氧状态下RAW264.7对LPS的刺激非常敏感。0.1 ng/ml低剂量至1000ng/ml高剂量LPS均可使RAW264.7细胞产生大量的TNF-α,比未经处理的RAW264.7细胞中TNF-α基本值增加10倍以上。SB203580对LPS诱导RAW264.7细胞产生的TNF-α具有非常明显的抑制效果,可以抑制90%以上TNF-α的产生,并且呈剂量依赖方式,高于SB203580 10μM或1μM的剂量均能有效抑制LPS1 ng/ml或0.1 ng/ml刺激RAW264.7细胞产生的TNF-α,低于这个剂量则对相应LPS刺激产生的TNF-α无明显抑制作用。2.在无LPS刺激的情况下,低氧（0.5%O2）或者氯化钴模拟低氧刺激仅使TNF-α的基线值大约升高2倍（p＜0.05,n=3）。与正常氧浓度下相比,LPS在低氧浓度状态下刺激TNF-α产生仅有微小的增加（无统计学意义）,并且氯化钴具有很好的模拟低氧的效果。SB203580（10μM）不但可以在正常氧浓度下完全抑制LPS诱导的TNF-α产生（p＜0.05,n=3）,而且可以抑制单独由低氧诱导的TNF-α产生。但是在低氧或者氯化钴模拟低氧状态下观察不到SB203580对LPS诱导的TNF-α蛋白表达的明显抑制作用。3.SB203580能降低TNF-α在正常氧浓度状态下的转录水平（p＜0.05,n=3）。低氧和氯化钴刺激能提高LPS诱导的TNF-αmRNA表达,从而对抗SB203580的抑制作用。4.低氧状态下LPS刺激TNF-α产生增多和达到峰值水平的时间比正常氧浓度状态下均提早约2 h。SB203580在正常氧浓度状态下可以抑制TNF-α的产生一直维持在基线水平;SB203580在低氧浓度下抑制TNF-α产生的动态曲线与正常氧浓度下LPS单独刺激的诱生曲线平行。5.Western blot结果显示,在正常氧浓度下,磷酸化有活性的p38 MAPK（p-p38）可在加入LPS后10min检测到,30 min达到峰值状态,60 min有所减弱。在氯化钴模拟低氧状态下可观察到p-p38类似的表达模式。但在不同氧状态下SB203580并没有影响p38和p-p38的表达量。在正常氧浓度状态下,磷酸化的MAPKAPK2（p-MK2）在接受LPS刺激10min可检测到,30 min检测到p-MK2最大量的表达,60 min表达衰减。低氧状态下p-MK2在30和60 min时间点的表达量比正常氧浓度状态下明显增加,而SB203580对此表达模式没有明显影响。6.Real-time PCR比较显示低氧可以提高TNF-αmRNA的稳定性。分析TNF-αmRNA在30 min时间点的相对表达量,SB203580在正常氧浓度下并不影响TNF-αmRNA的稳定性（p＞0.05,n=3）,在低氧状态下可以一定程度的降低其稳定性（p＜0.05,n=3）。7.低氧刺激对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的基线水平没有明显影响（p＞0.05,n=3）。LPS在正常氧浓度状态下以剂量依赖方式刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α,在低氧状态下不同剂量LPS的刺激效果没有明显区别（p＞0.05,n=3）。小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α受低氧和SB203580影响的的模式与RAW264.7相似,低氧可使SB203580的抑制能力大约降低50%。8.小鼠在正常氧浓度环境下接受不同剂量LPS 90 min后,血清TNF-α水平与正常对照组小鼠比较均有明显升高（p＜0.05,n=3）。在正常氧浓度和低氧环境下（10%O2）,15 mg/kg和25 mg/kg剂量的SB203580均不能降低0.5 mg/kg LPS诱导的内毒素血症小鼠血清TNF-α水平（p＞0.05,n=3）。小鼠在注射LPS 0.5mg/kg后240 min与90 min急性期比较,血清TNF-α水平有所下降（p＜0.05,n=3）,24 h基本降至正常水平。9.小鼠接受LPS注射90 min肺组织中已经可检测到HIF-1αmRNA。Real-timePCR比较发现HIF-1αmRNA的表达水平在SB203580治疗组和对照组之间没有明显差别（p=0.34）。同时Western blot和免疫组化染色均可检测到HIF-1α蛋白的表达。免疫组化染色显示LPS注射90 min后HIF-1α蛋白主要位于在肺间质组织中。LPS注射240 min后,免疫染色阳性的细胞数目减少。与Western blot检测结果一致,SB203580并没有影响HIF-1α蛋白的表达量。研究结论1.低氧可以增强p38 MAPK的活性。p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580在正常氧浓度下可以完全抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7中TNF-α表达,但在低氧（0.5%O2或氯化钴模拟低氧）状态下却失去了这种抑制能力。2.低氧影响小鼠腹腔巨噬细胞对LPS反应和SB203580的抑制效果的模式与RAW264.7细胞相似。3.低氧可以增强TNF-α的转录活动及mRNA的稳定性。SB203580在正常氧浓度下可以抑制TNF-α的转录,但并不能影响mRNA的稳定性。4.低氧并不影响p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达量,而是通过增强p38的活性,增加下游底物p-MK2的表达,从而增加TNF-α的合成。5.HIF-1α在内毒素血症模型小鼠肺组织中表达,并且其表达水平不受SB203580的影响。SB203580不能有效降低伴随低氧状态的内毒素血症小鼠血清TNF-α水平。6.低氧可能通过HIF-1α介导TNF-α的生物合成,并且调节通路不受p38抑制剂的影响,可能与p38通路起到协同作用。创新及意义1.本研究阐述了低氧在脓毒症TNF-α生物合成中起重要作用,低氧可提高p38 MAPK的活性,解释了p38抑制剂SB203580在脓毒症及脓毒性休克中具有争议性的体内应用效果。2.本研究提示HIF-1α可能参与调节TNF-α的生物合成,低氧通过HIF-1α的信号传导可能独立于p38信号通路,并且两条通路有协同作用。我们的发现为理解低氧在脓毒症和脓毒症休克病理过程中的作用提供了新视角。3.本研究提示在脓毒症和脓毒症休克的临床治疗中,除了TNF-α的生物合成机制,低氧的伴随病理状态也是必须考虑因素之一,为脓毒症的治疗提供了新的靶点和理论依据。