掺杂Tb纳米羟基磷灰石的工艺优化与性能评价

论文摘要

目的：探讨水热合成法中工艺参数对调控纳米羟基磷灰石（HAnp）粒径的作用,并研究掺杂铽（Tb）对HAnp性能的影响,评价Tb-HAnp生物相容性和胞吞作用,为构建HAnp为基因载体的表层基因化多孔钛种植体奠定基础。方法：1) HAnp制备工艺的优化：采用水热合成法,通过调节工艺参数,调控HAnp的粒径,以Ca（NO3）2·4H2O和（NH4）2HPO4为前驱反应物,设置（NH4）2HPO4不同滴加速率,在反应温度为170℃、反应时间为3h下制备HAnp;用X线衍射仪（XRD）分析其结构和物相,用透射电镜（TEM）表征其粒径、形貌与分散性。2)荧光化HAnp的制备：用水热合成法制备不同Tb掺杂量的HAnp荧光颗粒,设置Tb3+不同添加浓度,在（NH4）2HPO4滴加速率为0.12ml/min.反应温度170℃、反应时间3h的条件下制备Tb-HAnp;用XRD分析产物的结构和物相,TEM表征其粒径、形貌及分散性,Zeta电位分析仪检测Zeta电位,荧光显微镜观察其荧光性。3) Tb-HAnp的细胞毒性实验：用MTT法检测不同Tb添加量的HAnp在100μg/ml-2000μg/ml浓度范围内对L929的细胞毒性。4) Tb-HAnp与MG63细胞共培养：将不同添加量Tb-HAnp与MG63细胞共培养48h,在倒置显微镜和荧光显微镜下观察胞吞情况。结果：1)用水热合成法,调控（NH4）2HPO4滴加速率,可控制HAnp的粒径、形貌和分散度,其中滴加速率为0.12ml/min组的HAnp平均粒径为30nm,呈球状或短棒状,分散性良好。2)不同Tb添加量的HAnp在纯HAnp衍射谱的基础上均出现了新的衍射峰,该衍射峰对应的结构为TbPO4.H2O,表明Tb3+已掺入HAnp;从TEM结果可看出,在0mol%-5mol%范围内,随Tb添加量的增加,HAnp的粒径也逐渐增加,在5mol%-10mol%范围内,HAnp的粒径随Tb添加量的增加,其粒径有减小的趋势,提示Tb对HAnp的生长优势取向有调控作用；Zeta电位结果显示,在0mol%-5mol%范围内,随Tb添加量的增加,HAnp的Zeta电位从-7.60mV负向升高到-18.3mV,在5mol%～10mol%范围内,随Tb添加量的增加,HAnp的Zeta电位从-18.3mV负向降低至-6.73mV,提示HAnp的Zeta电位变化趋势与其粒径大小有一定的相关性；用荧光显微镜观察Tb-HAnp的荧光性,发现在紫外光激发下掺杂Tb的HAnp可见明显的绿色荧光,荧光颗粒数随Tb添加量增大而增多,未添加Tb的HAnp则未观测到荧光表现。3)MTT法检测不同Tb添加量的HAnp的细胞毒性。倒置显微镜下,实验组与阴性对照组的细胞形态正常,伸展良好,实验组中可见不规则的团聚体,团聚体随Tb-HAnp浓度的增大而增多且对细胞生长无明显影响,而阳性对照组完全裂解,失去正常的细胞结构和形态,呈残渣和碎片样表现；统计学分析显示,三种不同Tb添加量的HAnp在100μg/ml-2000μg/ml范围内的RGR值与阳性对照组比较均有显著差异（P<0.05）,细胞毒性分级均在1级以内。4)Tb-HAnp与MG63细胞共培养,在倒置显微镜和荧光显微镜下观察其胞吞情况。倒置显微镜下,实验组与对照组的细胞形态正常、伸展良好,各实验组细胞内均显示有高密度、不规则的团块影像,团块的数目与体积随Tb-HAnp添加量的增大而增多；荧光显微镜下,对照组表现为完全的暗视野,而实验组中均出现了绿色荧光体,荧光体的位置和形态与普通光镜中高密度团块相对应,提示细胞内的物质为Tb-HAnp。结论：1)采用水热合成法制备HAnp,通过控制（NH4）2HPO4滴加速率可调节HAnp的粒径,当（NH4）2HPO4滴加速率为0.12ml/min, HAnp平均粒径可控制在30nm,呈球状或短棒状,分散性良好；2)掺杂Tb的HAnp具有荧光特性,在荧光显微镜下Tb添加量为10mol%的HAnp荧光性最优；3) Tb-HAnp无细胞毒性,与MG63细胞共培养,可见Tb-HAnp通过胞吞作用进入细胞内。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 细胞系
• 2.1.3 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 HAnp制备工艺的优化
• 2.2.2 荧光化HAnp的制备
• 2.2.3 Tb-HAnp的细胞毒性实验
• 2.2.4 Tb-HAnp与MG63细胞共培养
• 第三章 结果
• 3.1 HAnp制备工艺的优化
• 3.1.1 XRD
• 3.1.2 TEM
• 3.2 Tb-HAnp的制备
• 3.2.1 XRD
• 3.2.2 TEM
• 3.2.3 Zeta电位
• 3.2.4 倒置荧光显微镜
• 3.3 Tb-HAnp的细胞毒性实验
• 3.3.1 倒置显微镜
• 3.3.2 统计学结果
• 3.4 Tb-HAnp与MG63细胞共培养
• 3.4.1 倒置显微镜
• 3.4.2 倒置荧光显微镜
• 第四章 讨论
• 4.1 工艺参数对HAnp粒径的影响
• 4.2 掺杂Tb对HAnp性能的影响
• 4.3 HAnp的胞吞作用
• 4.4 展望
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果