检测J亚群禽白血病病毒抗体的间接ELISA方法建立和针对gp85蛋白的单克隆抗体研制

论文摘要

J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是反转录病毒科α肿瘤病毒属的禽白血病病毒/禽肉瘤病病毒群中的一个亚群,由英国学者Payne于1991年在肉鸡上发现。该病毒主要引起鸡的髓细胞瘤白血病,给世界上许多国家的养鸡业带来了巨大的经济损失。ALV-J既可水平传播,又可垂直传播。目前,种群净化是防控J亚群禽白血病的有效措施,因此有必要建立起准确、快速、灵敏的ALV-J检测技术。本研究采用PCR方法克隆出本室分离保存的JS-9-09-Ch株ALV完整的gp85基因,并进行测序,上传序列获得GenBank登录号为：JF911743。分别克隆到pET-32a（+）和pGEX-6P-1载体,构建重组质粒pET-32a（+）-gp85和pGEX-6P-1-gp85。将重组质粒转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达gp85融合蛋白。表达的融合蛋白分别用High-Affinity Ni-IDA Resin和High-Affinity GST Resin纯化。以His-gp85融合蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫SPF鸡,每隔两周进行加强免疫,制备抗gp85的阳性血清。以GST-gp85包被酶标板、抗gp85阳性血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为二抗,建立起检测ALV-J gp85抗体的间接ELISA方法。经过对反应条件进行优化,确定GST-gp85最佳包被浓度为0.05μg/孔,阳性血清的稀释倍数为1：500,血清作用时间为60min。将纯化的GST-gp85融合蛋白用等量的弗氏完全佐剂乳化,皮下多点免疫6周龄BALB/c小鼠,免疫剂量为200μg/只；每隔两周以相同的方法以弗氏不完全佐剂与抗原乳化后加强免疫,免疫剂量为100μg/只；第四次免疫后两周,以GST-gp85融合蛋白按100μg/只的剂量加强免疫,4d后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。用纯化的His-gp85包被ELISA反应板,间接ELISA法筛选阳性克隆,并对阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆,获得6株稳定分泌抗gp85单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以5×105个/只的杂交瘤细胞数量腹腔注射BALB/c小鼠制备腹水,并对单抗进行相应生物学特性鉴定。Western-blot试验表明,研制的单抗针对ALV-J gp85蛋白。单抗间接免疫荧光试验对感染ALV-J的DF1细胞呈阳性反应,为ALV-J的检测提供了新方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述 J亚群禽白血病诊断方法研究进展
• 1 病毒的分离与鉴定
• 2 病理组织学诊断
• 3 血清学诊断
• 3.1 病毒中和试验
• 3.2 ELISA方法
• 3.3 琼脂双向扩散试验
• 3.4 免疫荧光试验
• 4 分子生物学诊断
• 5 其他诊断与检测方法
• 第一章 检测J亚群禽白血病病毒抗体的间接ELISA方法建立
• 1 材料
• 1.1 细胞系、实验动物、质粒及菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基及相关溶液的配制
• 1.4 仪器设备
• 1.5 分子生物学软件
• 2 方法
• 2.1 ALV-J gp85基因的克隆
• 2.2 ALV-J gp85基因的原核表达
• 2.3 目的蛋白的诱导表达及纯化
• 2.4 检测ALV-J gp85抗体的间接ELISA方法建立
• 2.5 与IDEXX公司ALV-J抗体检测试剂盒的符合性试验
• 3 结果
• 3.1 ALV-J gp85基因的克隆
• 3.2 重组表达载体的构建
• 3.3 目的蛋白的表达鉴定及纯化
• 3.4 检测ALV-J gp85抗体的间接ELISA方法建立
• 3.5 与IDEXX公司ALV-J抗体检测试剂盒的符合性试验
• 4 讨论
• 第二章 J亚群禽白血病病毒gp85蛋白的单克隆抗体研制
• 1 材料
• 1.1 细胞系及实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 器械及器皿
• 1.5 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 动物免疫
• 2.2 融合
• 2.3 检测方法的建立
• 2.4 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆
• 2.5 腹水的制备及单抗特性的生物学鉴定
• 2.6 针对不同抗原表位的单抗区分鉴定
• 3 结果
• 3.1 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2 单抗的生物学特性鉴定
• 3.3 间接免疫荧光
• 3.4 单抗的Western-blot
• 3.5 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性
• 3.6 酶标单抗的工作浓度
• 3.7 针对不同抗原表位的单抗初步鉴定
• 3.8 间接免疫荧光试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章