抗人L-PGDS基因工程抗体的构建及表达

论文摘要

Lipocalin型前列腺素D合成酶（Lipocalin-type Prostagladin D Synthase,L-PGDS）亦称β-trace蛋白,是机体组织屏障的主要成分,属Lipocal in家族。L-PGDS主要分布于哺乳动物的中枢神经系统和雄性生殖器官,并分泌至脑脊液、血清、精液、尿液、羊水等体液中。L-PGDS是一种双功能蛋白,除催化PGD2产生外,亦可结合和运输亲脂/疏水分子。该蛋白具有广泛的生理学作用,它不仅与睡眠诱导、体温调节、感受伤害、气味应答等有关,亦是一种生育相关蛋白,可能参与精子的发生和成熟。研究表明,L-PGDS与许多疾病密切相关,如L-PGDS不同程度地表达于卵巢癌、乳腺癌等组织,病毒性脑膜炎、脑脊膜瘤、椎管狭窄、脑栓塞等病人的CSF中L-PGDS明显升高。 为了建立L-PGDS的免疫学检测方法并探讨其在男性生殖系统中的具体功能、代谢过程、作用机制以及与男性不育的关系等,本实验室以毕赤氏酵母表达了人睾丸L-PGDS抗原,成功制备了兔抗人L-PGDS多克隆抗体和鼠抗人L-PGDS单克隆抗体。兔源多抗实际上是多种抗体的混合物,具有不均一性,无论是对抗体分子结构与功能的研究还是临床应用都受到很大限制;而特异性鼠单抗具有异源性,应用于人体研究会引发人抗鼠抗体的毒性反应,并使抗体在体内消除加快等。因此,应用于临床的理想抗体应是人源的,但人一人杂交瘤技术目前尚未突破,且还存在人-人杂交瘤体外传代不稳定、抗体亲合力低及产量不高等问题。目前解决此问题的较好办法之一是研制基因工程抗体,代替鼠源单抗应用于临床。本研究试利用基因工程技术,构建和表达目前研究较多也较成熟的单链抗体、人—鼠嵌合抗体,为L-PGDS的功能性研究以及临床相关疾病的诊断、治疗奠定基础。 本研究第一部分首先采用RT-PCR技术,以一组自前导序列的简并引物,从1株稳定分泌抗人L-PGDS单抗的鼠杂交瘤细胞中扩增出抗体的轻链可变区基因2个、重链可变区基因1个:然后分别克隆至pGEM-T载体,并测序。测序结果表明,其中1个V k为鼠骨髓瘤细胞系中固有的无功能基因:另一V k和VH经KabatIg比对分析,与其同源性较高的序列均为鼠免疫球蛋白可变区基因,且碱基序列符合鼠抗体可变区特征。 本研究第二部分利用一柔性连接短肽[（Gly）4Set]3,SOE PCR法将上述重、

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 引言
• 1.2 单链抗体的研究进展
• 1.2.1 单链抗体的构建
• 1.2.2 单链抗体的表达
• 1.2.3 单链抗体的应用
• 1.2.4 单链抗体的前景展望
• 1.3 嵌合抗体的研究进展
• 1.3.1 嵌合抗体的研制
• 1.3.2 嵌合抗体的真核表达
• 1.4 小结
• 2 抗人L-PGDS抗体可变区基因的克隆及序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要实验材料、仪器和试剂
• 2.2.2 PCR引物设计与合成
• 2.2.3 细胞总RNA提取
• 2.2.4 逆转录反应
• 2.2.5 PCR扩增抗人L-PGOS单抗可变区基因
• 2.2.6 目的基因的分离、纯化及加尾
• 2.2.7 重组载体pGEM-T/VL、pGEM-T/VH的构建及转化
• 2.2.8 重组质粒的鉴定
• 2.2.9 目的基因的测序及序列分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 RT-PCR扩增抗人L-PGDS抗体可变区基因
• 2.3.2 重组载体的构建及鉴定
• 2.3.3 抗人L-PGOS抗体可变区基因的测序及序列分析
• 2.4 讨论
• 3 抗人L-PGDS单链抗体的构建及表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要实验材料、仪器和试剂
• 3.2.2 PCR引物的设计与合成
• 3.2.3 抗人L-PGDS ScFv基因的克隆
• 3.2.4 原核表达载体pET-28a（+）/ScFv的构建及转化
• 3.2.5 抗人L-PGDS ScFv的诱导表达
• 3.2.6 重组蛋白抗人L-PGDS ScFv的纯化
• 3.2.7 双夹心酶联免疫吸附法检测目的蛋白抗原结合活性
• 3.2.8 目的抗体蛋白的效价测定
• 3.2.9 免疫荧光竞争抑制法检测目的蛋白抗原结合特异性
• 3.3 结果
• 3.3.1 抗人L-PGDS ScFv基因的克隆
• 3.3.2 重组表达载体pET-28a（+）/ScFv的双酶切鉴定
• 3.3.3 ScFv目的基因序列测定
• 3.3.4 重组质粒pET-28a（+）/ScFv的诱导表达
• 3.3.5 重组蛋白ScFv的纯化
• 3.3.6 双夹心ELISA检测L-PGDS ScFv的抗原结合活性
• 3.3.7 目的抗体蛋白的效价测定
• 3.3.8 免疫荧光竟争抑制法检测L-PGDS ScFv的抗原结合特异性
• 3.4 讨论
• 4 抗人L-PGDS人—鼠嵌合抗体的构建及表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要实验材料、仪器和试剂
• 4.2.2 抗人L-PGDS人—鼠嵌合抗体表达载体的构建及鉴定
• 4.2.3 重组轻链表达载体pAG4622/VL的Sp2/0细胞转染及筛选
• 4.2.4 细胞克隆的ELISA初步检测
• 4.2.5 阳性克隆的有限稀释
• 4.2.6 稳定分泌嵌合轻链细胞的扩大培养及ELISA检测
• 4.2.7 稳定分泌嵌合轻链细胞的RT-PCR检测
• 4.2.8 重组重链表达载体pAH4604/VH的Sp2/0细胞共转染及筛选
• 4.3 结果
• 4.3.1 抗人L-PGDS人—鼠嵌合抗体表达载体的构建及鉴定
• 4.3.2 人—鼠嵌合轻链在SP2/0细胞中的稳定表达及ELISA检测
• 4.3.3 人—鼠嵌合轻链的RT-PCR检测
• 4.4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 研究生期间的主要学术成果
• 致谢