大豆高效整个子叶节再生体系的建立及根癌农杆菌介导的双价抗虫基因在大豆上的转化

论文摘要

大豆是世界上重要的油料作物以及植物蛋白来源之一,因此大豆基因工程育种具有重要的意义。实验采用一种新的技术方法即大豆整个子叶节为外植体,利用直接芽再生方式建立了一种新的快速有效的再生体系,并在此平台上用双价抗虫基因对大豆进行了遗传转化。成熟大豆种子消毒后在添加BA 0.4 mg L-1的MSB5培养基中培养了57 d得到无菌苗,切取整个子叶节外植体,将外植体转入不同芽诱导培养基中培养14 d后,转入MSB5培养基上进行芽伸长培养,至芽伸长到34 cm,转至含有IBA 0.5 mg L-1的MSB5培养基上进行生根培养,炼苗并移栽到温室得到可育植株。实验中,对芽的形态发生过程以及细胞内淀粉和蛋白质含量的相对变化进行了观察分析,发现分生细胞内蛋白质含量随着芽发育的不同阶段呈周期性变化;研究了BA或CPPU对大豆整个子叶节芽诱导的作用,确定了BA在整个子叶节芽诱导过程中效果好于CPPU;利用正交设计方法对三种植物激素以及大豆基因型对芽诱导的影响进行研究,结果表明,BA、KT、IBA对芽诱导效果都有极显著影响,其中BA的影响最大,大豆品种合丰25在MSB5 + BA 3.0 mg L-1 + IBA 0.2 mg L-1 +KT 0.5 mg L-1的培养基中诱导出芽效果最好,每个外植体可以得到3035个芽,并且大部分芽都可以伸长并生根。为了验证新建立的再生体系的效果,将此再生体系与传统的大豆子叶节再生体系、近几年应用较多的大豆胚尖再生体系在再生频率、出芽数目、芽伸长情况以及再生周期等方面进行研究比较,结果表明,大豆整个子叶节再生体系在外植体再生频率以及出芽数量上优于其它两种体系。本实验尝试采用大豆整个子叶节为外植体建立了一种快速有效的再生体系,与子叶节、胚尖再生体系相比较,提高了再生效率和不定芽的数量,减小了品种特异性对大豆再生体系的影响,并且大大缩短了再生周期。研究结果表明,使用这个再生平台,再生效率达到95%以上,可以在60天内获得大量的再生小苗。利用根癌农杆菌介导的转化方法对三个大豆品种的整个子叶节外植体进行双价抗虫基因的遗传转化,并对转化体系中几个因素进行优化,建立了基于整个子叶节再生平台的大豆遗传转化体系。结果表明,不同农杆菌菌株对大豆的转化效率不同,EHA105的转化效率高于LBA4404和GV3101;不同大豆品种对农杆菌浸染的敏感性存在差异,其中合丰48的效果较好;转化过程中采用Cef 300 mg L-1 + Cb 200 mg L-1和PPT 5.0 mg L-1进行除菌和筛选,效果较好。应用这个转化体系,转化频率在5.50%12.07%之间。经过分子验证以及抗除草剂、抗蚜虫实验证明,外源基因已经整合到大豆基因组中,T1代遗传分析结果表明外源基因在后代中可以稳定遗传和表达,并对大豆蚜虫具有较强的抗性。实验证明,大豆整个子叶节再生体系可以有效地用于农杆菌介导的遗传转化并得到稳定表达的转基因植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1.1 大豆遗传转化方法
• 1.1.1 农杆菌介导法
• 1.1.2 基因枪法
• 1.1.3 花粉管通道法
• 1.1.4 其它几种转化方法
• 1.1.4.1 聚乙二醇法
• 1.1.4.2 电激法
• 1.1.4.3 脂质体法
• 1.1.4.4 显微注射法
• 1.1.4.5 农杆菌介导原位转基因方法
• 1.2 大豆转化受体系统
• 1.2.1 器官发生体系
• 1.2.1.1 子叶节
• 1.2.1.2 其它器官发生体系
• 1.2.2 胚性悬浮培养
• 1.2.3 原生质体
• 1.2.4 子房
• 1.2.5 发状根
• 1.3 植物抗虫基因的研究和利用
• 1.3.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因
• 1.3.2 蛋白酶抑制剂基因
• 1.3.2.1 豇豆胰蛋白酶抑制剂基因
• 1.3.2.2 马铃薯蛋白酶抑制剂基因
• 1.3.2.3 水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因
• 1.3.3 植物凝集素基因
• 1.3.3.1 雪花莲外源凝集素基因
• 1.3.3.2 豌豆凝集素基因
• 1.3.3.3 麦胚凝集素基因
• 1.3.3.4 半夏凝集素基因
• 1.3.4 其它抗虫基因
• 1.3.4.1 淀粉酶抑制剂基因
• 1.3.4.2 几丁质酶基因
• 1.3.4.3 昆虫毒素基因
• 1.3.5 其它抗虫基因工程方法
• 1.4 植物抗虫基因工程研究中存在的问题及策略
• 1.4.1 外源基因表达的稳定性
• 1.4.2 昆虫产生抗性
• 1.4.3 标记基因的安全性
• 1.5 大豆抗虫基因工程研究展望
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二部分 大豆整个子叶节再生体系的建立以及与子叶节、胚尖再生体系的比较研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试大豆品种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 基本培养基
• 2.1.2.2 大豆整个子叶节外植体不同阶段的培养基
• 2.1.2.3 三种不同外植体不同阶段的培养基条件
• 2.1.3 实验步骤
• 2.1.3.1 外植体获得及不定芽再生
• 2.1.3.2 大豆不定根的诱导与再生植株的形成
• 2.1.4 培养条件
• 2.1.5 石蜡切片
• 2.1.5.1 染色方法
• 2.1.5.2 石蜡切片的步骤
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 大豆整个子叶节再生体系的建立和优化
• 2.2.1.1 不同预处理对大豆种子萌发和芽再生的影响
• 2.2.1.2 CPPU 和BA 在诱导大豆整个子叶节外植体芽再生的比较
• 2.2.1.3 利用正交设计筛选最适芽诱导培养基以及考察几个因素的影响
• 2.2.1.4 整个子叶节再生体系的建立
• 2.2.2 整个子叶节再生过程中的组织化学观察
• 2.2.3 三种目前常用的大豆器官发生再生体系的比较
• 2.2.3.1 三种不同外植体不同培养时间出芽以及芽伸长情况的比较
• 2.2.3.2 三种外植体培养30 d 后再生频率的比较
• 2.2.3.3 三种不同外植体再生周期的比较
• 2.3 讨论
• 第三部分 根癌农杆菌介导的双价抗虫基因在大豆上的转化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.1.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.1.2 质粒DNA 冻融法转化三种根癌农杆菌
• 3.1.2 农杆菌介导的大豆整个子叶节转化体系
• 3.1.2.1 供试大豆品种
• 3.1.2.2 大豆组织培养和遗传转化中所使用的培养基及其成分
• 3.1.2.3 农杆菌的培养
• 3.1.2.4 根癌农杆菌介导的大豆整个子叶节再生和遗传转化
• 3.1.3 大豆转化植株的分子验证和抗性检测
• 3.1.3.1 PCR 检测
• 3.1.3.2 转基因植株Southern blot 分析
• 3.1.4 除草剂抗性检测
• 3.1.5 蚜虫抗性检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 抗生素和除草剂浓度筛选
• 3.2.2 不同农杆菌菌株和大豆基因型对转化效率的影响
• 3.2.3 转基因植株的分子鉴定
• 3.2.3.1 转基因植株的PCR 检测
• 3.2.3.2 Southern 杂交鉴定
• 1 代）的抗除草剂测试'>3.2.4 转基因后代（T₁代）的抗除草剂测试
• 3.2.4.1 草丁膦浓度的确定
• 3.2.4.2 转基因植株抗除草剂鉴定
• 1 代）抗蚜虫鉴定与遗传分析'>3.2.5 转基因植株后代（T₁代）抗蚜虫鉴定与遗传分析
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩写词表
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文和专利