D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达及其固定化转化D-阿洛酮糖的研究

论文摘要

D-阿洛酮糖是一种新型低热量的功能性因子,D-果糖的差向异构体,在自然界存在极少,可以应用于食品、医药和保健等领域。D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase,缩写为DPE）是一种可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖进行可逆反应的胞内异构化酶。鉴于D-阿洛酮糖多应用于食品领域,本文选用食品级微生物枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为表达宿主。本文构建了高效表达来源于Clostridium cellulolyticum H10的DPE基因（CCDPE）以及来源于Ruminococcus sp.的DPE基因（RDPE）的重组枯草芽孢杆菌工程菌株。研究了CCDPE在重组枯草芽孢杆菌中的表达与纯化、酶学性质、酶的固定化以及与两种重组酶的理化性质比较等方面的内容。来源于Clostridium cellulolyticum H10的DPE基因片段大小约为882 bp,蛋白分子量约为33 kDa。用LB-Kana培养基（Kana含量50μg/mL）在37℃、200 rpm条件下培养重组菌株,收获菌体后经超声波细胞破碎仪破碎、离心收集上清液,用Ni-NTA亲和层析柱和Source 15Q阴离子交换柱提纯目的蛋白。SDS-PAGE结果表明,目的蛋白为可溶性表达,条带特异性强,纯化效果较为理想,纯度可以达到90%以上。纯化的CCDPE酶酶学性质研究表明,其最适温度50℃、最适pH 8.0,其活性不依赖金属离子,但Co2+对其有强烈的促进作用,酶促动力学反应结果表明,该酶对D-阿洛酮糖具有较高的底物特异性。本文还采用了不同载体材料和固定方法对CCDPE粗酶固定化工艺影响的研究,综合得出,以壳聚糖为载体固定CCDPE粗酶效果比较好,在对固定化工艺条件优化后得出当固定时间为3 h,[酶]：[载体]=15：1（U/g）时酶活回收率最高为45%。另外,本文也采用此固定化方法对枯草芽孢杆菌中表达的Ruminococcus sp,的DPE粗酶进行固定化研究。对CCDPE自由酶、CCDPE固定化酶、RDPE自由酶和RDPE固定化酶的最适pH、最适温度以及金属离子等酶学性质进行比较,结果表明,对CCDPE而言,其固定化酶的最适温度（55℃）和pH（8.5）都高于自由酶（50℃、8.0）；对RDPE而言,其固定化酶的最适温度较自由酶相比没有明显改变,均为60℃,但其固定化酶的pH（9.0）高于自由酶（8.0）; Ni2+、Cu2+和Zn2+均对CCDPE自由酶与固定化酶以及RDPE自由酶与固定化酶酶活性有抑制作用,C02+和Mn2+对CCDPE自由酶酶活性有强烈的促进作用,Mn2+和Fe3+还对RDPE自由酶酶活性有强烈的促进作用。将CCDPE固定化装入填充床反应器进行连续转化反应,并研究流速对反应产率和转化率影响。在最佳流速为2.5 mL/min时,转化率为19%,相关产率为6.7g/L-h。当固定化酶连续反应168 h,转化率能保持在13%以上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 食品级微生物
• 1.1.1 食品级微生物的简介与应用
• 1.1.2 枯草芽孢杆菌及其表达系统
• 1.2 功能性稀少糖
• 1.3 D-阿洛酮糖的介绍
• 1.3.1 D-阿洛酮糖的结构来源与理化性质
• 1.3.2 D-阿洛酮糖的功能
• 1.3.3 D-阿洛酮糖的生产方法
• 1.4 D-阿洛酮糖3-差向异构酶
• 1.4.1 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物来源
• 1.4.2 微生物来源D-阿洛酮糖3-差向异构酶的性质
• 1.4.3 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化
• 1.5 本课题立题背景及研究意义
• 1.5.1 构建含DPE基因载体的食品级重组枯草芽孢杆菌研究价值
• 1.5.2 D-阿洛酮糖研究方面意义
• 1.6 论文研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种及载体
• 2.1.2 化学试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基的选择及制备
• 2.2.2 D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活检测
• 2.2.3 C cellulolyticum H10 DPE与Ruminococcus sp.DPE基因序列扩增
• 2.2.4 C cellulolyticum H10 DPE与Ruminococcus sp.DPE基因表达质粒的构建
• 2.2.5 C cellulolyticum H10 DPE基因在B.subtilis WB600中的表达
• 2.2.6 C cellulolyticum H10 DPE的纯化
• 2.2.7 C cellulolyticum H10 DPE酶学性质研究
• 2.2.8 C cellulolyticum H10 DPE的固定化工艺研究
• 2.2.9 C cellulolyticum H10 DPE固定化酶与Ruminococcus sp.DPE固定化酶之间理化性质对比
• 3 结果与讨论
• 3.1 CCDPE基因的克隆
• 3.1.1 CCDPE基因的扩增
• 3.1.2 CCDPE的C端含有组氨酸标签的重组质粒的构建
• 3.2 CCDPE基因在重组B.subtilis中的表达
• 3.3 CCDPE蛋白的纯化
• 3.4 CCDPE的酶学性质
• 3.4.1 温度对酶反应的影响
• 3.4.2 pH值对酶反应的影响
• 3.4.3 金属离子对酶反应的影响
• 3.4.4 底物特异性研究
• 3.4.5 酶反应动力学研究
• 3.5 CCDPEase固定化工艺研究
• 3.5.1 不同固定化方法对酶活回收率的影响
• 3.5.2 固定化工艺条件的优化
• 3.5.3 CCDPE固定化酶理化性质
• 3.6 Ruminococcus sp.DPE基因的克隆表达
• 3.6.1 Ruminococcus sp.DPE基因的扩增
• 3.6.2 含RDPE基因的重组质粒的构建（不含组氨酸标签）
• 3.6.3 RDPE基因在重组B.subtilis 168中的表达以及与含CCDPE基因的在重组B.subtilis WB600的表达的情况之间的对比
• 3.7 RDPE固定化酶与CCDPE固定化酶理化性质之间的比较
• 3.7.1 温度对RDPE固定化酶与CCDPE固定化酶酶活的影响
• 3.7.2 pH对RDPE固定化酶与CCDPE固定化酶酶活的影响
• 3.7.3 金属离子对RDPE固定化酶与CCDPE固定化酶酶活的影响
• 3.7.4 RDPE固定化酶的热稳定性
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢