金鱼Tgf2转座子的研究及其转基因应用

论文摘要

转座子是基因组上的一段一定长度的DNA序列,能在自身编码的转座酶或逆转录酶的作用下,发生自我剪切或复制,并且在基因组DNA中移动位置的基本单位。如青鳉Tol2转座子（Transposable element of Oryzias latipes, number 2）和鲑鱼SB转座子（Sleeping Beauty Transposon）都以―剪切-粘贴‖的方式进行转座,即转座酶对转座子进行剪切,然后介导其插入到基因组内部。研究证明Tol2转座酶识别的是转座子末端反向重复序列和亚末端重复序列,当上述区域突变之后,其转座效率会明显下降。SB转座酶识别的末端重复序列大约长230bp,由外侧的反向重复序列（inverted repeats, IR）和内侧的同向重复序列（directly repeats, DR）及两者间的序列组成。根据它们的转座机制,国外学者构建了基于Tol2和SB转座子的转基因系统,即转基因供体质粒加转座酶辅助质粒的转基因体系。研究表明,两个转基因系统都具有广泛的通用性,近几年已在转基因、基因捕获和基因治疗研究中取得了重大进展。2008年,本实验室在19种不同鱼类物种或品系中进行PCR筛选,最后在我国金鱼品系中发现了一个新的hAT家族转座子,命名为金鱼Tgf2转座子。在此基础上,本研究进一步采用cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆了Tgf2转座酶全长cDNA,并对其表达进行了RT-PCR和原位杂交研究;其后,对Tgf2转座子的多态性进行了研究;最后,利用Tgf2转座子的左右末端和转座酶编码框（CDS）构建了具有自主知识产权的转基因系统,并在斑马鱼、草鱼、金鱼和鲫鱼等鲤科鱼类中开展了转基因研究。主要研究结果如下:1. Tgf2转座酶全长cDNA的克隆:共克隆得到7种转录本,分别命名为gfTP-1、gfTP-2、gfTP-3、gfTP-4、gfTP-5、gfTP-6、gfTP-7;经对其编码框进行预测,发现金鱼Tgf2转座子能编码产生3种长度的转座酶,其编码框长度分别为:2061bp（gfTP-1）、1953bp（gfTP-2和gfTP-3）和1734bp（gfTP-4、gfTP-5、gfTP-6和gfTP-7）,分别编码686个、650个和577个氨基酸残基;金鱼Tgf2 3种长度的转座酶间的差异主要体现在5端,与青鳉Tol2的3种转座酶序列相比较,发现两种鱼类的转座酶在序列上的相似度达99%,仅有7个氨基酸的差异。2.选取3种长度金鱼Tgf2转座酶mRNA的共有区设计引物,对金鱼不同组织总RNA进行RT-PCR分析,结果显示Tgf2转座酶基因在金鱼所有组织均有表达,以卵巢中表达量最高,其次为肝脏。对金鱼不同发育时期胚胎进行RT-PCR和整胚原位杂交分析,结果表明转座酶基因的表达模式在不同个体间具有明显时空差异。3.对珍珠、鹤顶红、红狮头、花狮头、琉金、蝶尾、龙睛、水泡眼和草金9个不同金鱼品系的基因组进行PCR分析,发现Tgf2转座子在金鱼各品系中均有分布;并揭示了在金鱼基因组中,Tgf2转座子既有完整拷贝也有包含缺失的拷贝。4.克隆了Tgf2转座子的220bp左末端和185bp右末端序列,并以此构建了基于Tgf2转座子的pTgf2-ef1α-eGFP、pTgf2-krt8-eGFP和pTgf2-ef1α-RFP转基因供体质粒;同时,利用Tgf2转座酶1734bp的编码区（编码577个氨基酸残基）构建了转座酶辅助质粒pCS2-gfTP。利用上述构建的转基因供体质粒和辅助质粒系统,在模式生物斑马鱼和常见养殖鲤科鱼类草鱼、鲫鱼及金鱼中进行了转基因研究。结果表明:Tgf2转基因系统可高效介导目的基因向受体基因组转座,在孵化后第6天（平游期）,草鱼阳性率约为52%,斑马鱼阳性率约为50%,鲫鱼阳性率约为53%;在一周龄时,报告基因在金鱼基因组中的转基因整合率为96%（27/28）,草鱼中为37%（73/200）。这些结果表明,本研究构建的Tgf2转基因系统可供在鲤科养殖鱼类中开展高效转基因研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 金鱼Tgf2 转座酶基因的克隆及表达分析
• 1.1 材料、仪器与试剂
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2.RNA 提取
• 1.2.3.RT-PCR
• 1.2.4.RACE
• 1.2.5 电泳检测与目的片段回收
• 1.2.6 连接与转化
• 1.2.7 重组子鉴定
• 1.2.8 原位杂交
• 1.3 结果
• 1.3.1 小片段扩增与序列比较
• 1.3.2 转座酶基因cDNA 全长及序列分析
• 1.3.3 转座酶表达的研究
• 1.4 讨论
• 第二章 金鱼基因组中Tgf2 转座子的多态性
• 2.1 材料、仪器与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2. DNA 提取
• 2.2.3. PCR 扩增
• 2.2.4 电泳检测与目的片段回收
• 2.2.5 连接与转化
• 2.2.6 重组子鉴定
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 Tgf2 转基因系统的构建及转基因研究
• 3.1 材料、仪器与试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 RNA 和DNA 提取
• 3.2.3 PCR 扩增
• 3.2.4 电泳检测与目的片段回收
• 3.2.5 连接与转化
• 3.2.6 重组子鉴定
• 3.2.7 双酶切与质粒重组
• 3.2.8 显微注射
• 3.2.9 PCR 检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 转基因系统
• 3.3.2 胚胎期的荧光观察
• 3.3.3 转基因阳性个体的PCR 检测
• 3.4 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢