论文摘要
目的头颈癌被认为是第七大常见肿瘤,其中鳞状细胞癌（Squamous cellcarcinoma of the head and neck,HNSCC）占头颈癌的90%。手术、放疗或手术联合放疗是头颈癌治疗的基础。近年来,随着放化疗联合治疗模式的逐步建立,晚期病人生存率和局部控制率有了一定程度的提高。然而在头颈癌放化疗治疗中仍然存在一些问题,如:放化疗毒副作用大、肿瘤对放化疗不敏感、治疗后病人复发率高、5年生存率低等。迄今为止,头颈癌放化治疗和疗效预测仍是肿瘤治疗的一个难题。肿瘤特异性分子的靶向治疗具有特异性强、在有效杀灭肿瘤细胞的同时不损伤正常组织的优点,它是针对可能导致细胞癌变的环节,从分子水平逆转这种恶性生物学行为,从而抑制肿瘤细胞生长的生物治疗模式。其中表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）是当前分子靶向治疗研究的热点。EGFR是ErbB酪氨酸激酶受体。该家族共有4个成员即EGFR/ErbB1,HER2/ErbB2,HER3/ErbB3及HER4/ErbB4。ErbB与特异的配体结合形成配体-受体二聚体,随后发生自身磷酸化,激活其下游主要信号通路,调节细胞功能,如细胞增殖、凋亡、血管形成、细胞粘附等,可导致细胞癌变,进而发生浸润及转移等。研究表明,80%-90%头颈鳞癌患者的EGFR为阳性。EGFR的过度表达与预后差、转移快、生存期短和放化疗不敏感等密切相关。EGFR的靶向药物主要有两类:一类为单克隆抗体,如西妥昔单抗（Cetuximab,Erbitux,IMC-C225）,它是特异性阻断EGFR的IgG1单克隆抗体,针对受体胞外配体连接区,阻止配体与受体的结合而抑制受体的激活。另一类为小分子酪氨酸激酶抑制剂,如易瑞沙（Gefitinib,Iressa,ZD1839）,主要抑制受体胞内酪氨酸激酶活性区。EGFR靶向药物只起到抑制肿瘤的作用,不能杀伤肿瘤细胞,其有效率在10%左右。因此,靶向治疗联合放化疗可能有利于提高疗效,减少副作用,是肿瘤治疗的发展趋势。目前,在晚期头颈鳞癌治疗中,有学者报道Cetuximab联合放疗或化疗提高了疗效。但Gefitinib联合放疗是否也有相似的疗效;Cetuximab联合化疗（Cisplatin）及常规放疗是否能提高疗效;以及对它们疗效的预测,国内外未见报道。本实验利用10株头颈鳞癌细胞克隆模型,分别比较单药治疗、联合治疗对细胞生存活性的影响,同时检测了10株HNSCC细胞的ErbB家族成员蛋白表达及信号通路关键因子,预测EGFR抑制剂在头颈鳞癌治疗中的疗效,为进一步提高头颈鳞癌治疗疗效,合理应用靶向治疗提供重要线索。方法一、研究对象新建的10株人头颈鳞癌细胞系,标记为UT-SCC（本文简写为SCC）。SCC-8,SCC-9,SCC-11,SCC-19a,SCC-29,SCC-34和SCC-38来源于喉癌（其中SCC-9源于颈转移,SCC-11源于复发病例）,SCC-24a1,SCC-24a2和SCC-40来源于舌癌。二、研究方法1、细胞培养:细胞系传代于15-30代之间。10%热灭活胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）DMEM培养基贴壁生长,孵育箱培养,0.01%胰蛋白酶（trypsin）及0.02%K-EDTA消化传代,每周传代1-2次,细胞维持在对数生长状态。2、克隆形成率分析法:Ham’s F-12（15%FBS）培养液。96孔培养板每孔细胞的接种数根据细胞植盘率（Plating efficiency,PE）调整。加干预因素,孵育箱培养4周,倒置显微镜下观查,每孔活细胞≥32个的孔作为阳性孔而计数。3、Western blot方法:检测人HNSCC细胞ErbB家族成员蛋白表达和活性。细胞裂解液以相同蛋白量上样,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分别进行一抗、二抗杂交,ECL显色。4、RT-qPCR方法:检测人HNSCC细胞ErbB家族成员mRNA表达。（1） Primer Express software设计引物和Taqman探针。（2）利用Trizol试剂提取细胞总RNA。（3）重组质粒pEBS7-EGFR作为标准品,actin为对照。三、实验分组1、96孔培养板克隆形成率分析法检测HNSCC细胞对三种药物（Cetuximab,Gefitinib,Cisplatin）的敏感性（IC70和IC50）。实验设细胞对照组和药物（5种不同浓度）处理组。2、96孔培养板克隆形成率分析法检测HNSCC细胞对Cetuximab或Gefitinib联合放疗疗效。Cetuximab/Gefitinib+Radiation:（1）单纯放射组:分0 Gy,0.75 Gy,1.25 Gy,2.5 Gy,5.0 Gy和7.5 Gy单次照射。（2）放射+药物组:放射剂量同上。Cetuximab或Gefitinib IC70。（3）放射+药物组:放射剂量同上。Cetuximab或Gefitinib IC50。3、96孔培养板克隆形成计数法检测HNSCC细胞对Cetuximab联合顺铂（Cisplatin）及放疗疗效。Cetuximab+Cisplatin+Radiation:（1）单纯放射组:分0 Gy,0.75 Gy,1.25 Gy,2.5 Gy,5.0 Gy和7.5 Gy单次照射。（2）放射+化疗组:放射剂量同上。Cisplatin IC70。（3）放射+化疗+药物组:化放疗方法同（2）,Cisplatin IC70,CetuximabIC70.（4）放射+化疗+药物组:化放疗方法同（2）,Cisplatin IC70,CetuximabIC50。四、疗效评价与统计分析1、细胞植盘率（PE）:PE=-In（阴性孔数量/全部孔数量）/每孔使用细胞数量。2、药物敏感性:Cetuximab,Gefitinib,Cisplatin的敏感性用IC50,IC70表示,即抑制50%,30%克隆形成所需的浓度。3、联合治疗疗效评价:（1）细胞存活分数（Survival fraction,SF）=（阳性孔数量/每孔使用细胞数量）×控制组每孔使用细胞数量/控制组中阳性孔数量。适用于线性二次（LQ）模型F=exp[-（αD+βD2）],拟合剂量生存曲线,（D表示剂量,α和β为剂量效应系数,α:为单击所产生的细胞死亡,即细胞存活曲线的初斜率;β:由于损伤累积而导致细胞死亡）。（2）通过数值整合获得曲线下面积（Area under the curve,AUC）值等同于平均致死（失活）剂量,AUC=1/α+（1.0）(DF-1)。联合放疗AUC率=（药物+放疗）AUC/放疗AUC;联合放化疗AUC率=（药物+放疗+化疗）AUC/放疗AUC。（3）联合治疗疗效评价采用细胞存活分数（SF）和AUC率的比较分析,比较分析采用t检验。药物剂量对超相加作用的影响采用单因素方差分析（ANOVA）。Cetuximab或Gefitinib联合放疗疗效和Cetuximab联合化疗（Cisplatin）及放疗的疗效评价采用“相加效应”（P＞0.05）即药物+放疗（或放化疗）的附加效应;“超相加效应”（P＜0.05）即大于药物+放疗（或放化疗）的附加效应亦即协同效应。4、相关性分析:ErbB表达与Cetuximab或Gefitinib药物敏感性（IC50）及放疗敏感性（AUC）的相关性采用Spearman统计分析,P＜0.05为有相关性。结果一、EGFR抑制剂及联合放化疗对头颈鳞癌治疗疗效1、10株HNSCC细胞的药物敏感性（1） Cetuximab,Gefitinib,Cisplatin IC70值变化范围:分别为0.22-4.08nM;0.036-4.8μM;0.038-0.22μg/ml。（2） Cetuximab,Gefitinib,Cisplatin IC50值变化范围:分别为0.58-8.2 nM;0.15-8.4μM;0.054-0.31μg/ml。（3） 10株HNSCC细胞对Cetuximab最敏感性的细胞系为SCC-24a2,SCC-40;10株HNSCC细胞对Gefitinib最敏感性的细胞系为SCC-24a2,SCC-19a;7株HNSCC细胞对Cisplatin最敏感性的细胞系为SCC-8,SCC-34。2、联合治疗疗效评价（1） Cetuximab联合放疗疗效评价:Cetuximab联合放疗的克隆形成率分析法结果显示,Cetuximab IC50剂量组对SCC-24a2疗效呈超相加效应（P＜0.05）,显著优于单纯放疗;对其它细胞系呈相加效应（P＞0.05,其中SCC-40的P=0.054）,优于单纯放疗。Cetuximab IC50剂量组联合放疗治疗中作用最敏感的两株细胞（SCC-24a2,SCC-40）与Cetuximab单药治疗中最敏感的两株细胞相一致。Cetuximab IC70剂量组对7株HNSCC细胞系均呈相加效应（P＞0.05）,优于单纯放疗。（2） Gefitinib联合放疗疗效评价:Gefitinib联合放疗的克隆形成率分析法结果显示,Gefitinib IC70和IC50剂量组对SCC-9,SCC-24a2,SCC-29,SCC-34和Gefitinib IC50剂量组对SCC-40疗效呈超相加效应（P＜0.05）,对其它细胞系呈相加效应（P＞0.05）,优于单纯放疗。（3） Cetuximab联合化疗（Cisplatin）及放疗疗效评价:Cetuximab联合化疗（Cisplatin）及放疗的克隆形成率分析法结果显示,Cetuximab IC70和IC50剂量组对SCC-24a和SCC-40疗效呈超相加效应（P＜0.05）;超相加效应的两株与Cetuximab单药疗效中最敏感的两株细胞系相同;对其它细胞系呈相加效应（P＞0.05）,优于单纯放疗或放化疗的疗效。二、检测EGFR信号通路关键因子分析其与药物疗效相关性1、Westerm blot方法检测检测人HNSCC细胞ErbB家族成员蛋白表达和活性:10株HNSCC细胞有不同程度的EGFR,ErbB2,ErbB3和pEGFR,pErbB2,pErbB3,pAkt,pErk表达。无ErbB4表达。2、RT-qPCR方法检测结果检测人HNSCC细胞ErbB家族成员mRNA表达:9株HNSCC细胞的4种基因有不同程度表达,高低依次为EGFR,ErbB2,ErbB3,ErbB4。3、ErbB表达与Gefitinib敏感性分析:ErbB3表达水平与HNSCC细胞对Gefitinib IC50抵抗性呈正相关性（P=0.02,r=0.71）。ErbB信号通路中pErbB2水平与Gefitinib IC50抵抗性呈正相关性（P=0.02,r=0.71）。4、ErbB表达与Cetuximab敏感性分析:EGFR蛋白表达水平与HNSCC细胞对Cetuximab IC50的抵抗性呈负相关（P=0.048,r=-0.64）。5、ErbB表达与HNSCC细胞放射敏感性分析:pErbB3表达与放疗平均致死剂量（AUC）呈正相关（P=0.0045,r=0.81）。结论1、HNSCC体外研究表明,Cetuximab或Gefitinib联合放疗的疗效优于单独放疗（相加效应）,Gefitinib（5株超相加效应）对HNSCC细胞的疗效优于Cetuximab（1株超相加效应）。在Cetuximab联合放疗中,Cetuximab IC50剂量组作用最敏感的两株细胞与Cetuximab单药治疗中最敏感的两株细胞相一致。在Cetuximab联合Cisplain及放疗中,使用Cetuximab（IC70/IC50）和低剂量Cisplatin（IC70）可以提高疗效（相加效应）,优于单纯放疗或放化疗,并且超相加作用的两株细胞与Cetuximab单药治疗中最敏感的两株细胞相一致。结果提示Cetuximab的敏感性可以预测Cetuximab联合放疗或联合放化疗的疗效。2、pErbB2和ErbB3表达水平与HNSCC细胞对Gefitinib抵抗性呈正相关;EGFR蛋白表达水平与HNSCC细胞对Cetuximab的抵抗性呈负相关;pErbB3表达与HNSCC细胞对放疗抵抗性呈正相关。提示pErbB2和ErbB3可预测Gefitinib抵抗性,EGFR可预测Cetuximab的敏感性,pErbB3可预测放疗抵抗性。