黄瓜连作障碍微生物修复研究

论文摘要

黄瓜是设施蔬菜中的主要作物,但是随着种植年限的增加,黄瓜连作障碍问题日益显著,已成为黄瓜产业发展的主要限制因素之一。在黄瓜连作障碍中,最重要的就是黄瓜枯萎病的发生。本文主要研究利用微生态修复解决黄瓜连作障碍问题。本研究主要包括4个部分:1以连作三年的黄瓜为研究对象,采取根部土壤,进行微生物区系研究,观察连作后土壤微生物种群的变化,以及优势菌的类型,为微生物修复黄瓜连作障碍提供理论基础。2以本研究室筛选的抑菌效果优良的3株放线菌为生防菌,研究其对黄瓜枯萎菌的抑制作用和机理,通过盆栽试验和大田试验研究了生防菌对黄瓜连作障碍的防治效果,并探讨了不同处理土壤微生物变化。3利用本研究室筛选保藏的放线菌资源,以黄瓜枯萎病病原菌为靶标菌,筛选新的对黄瓜枯萎病具有拮抗作用的放线菌,研究拮抗机理,并对性状优良放线菌菌进行生理生化和分子鉴定。4以对黄瓜枯萎菌具有良好拮抗效果的放线菌为研究对象,研究对黄瓜连作障碍有主要影响作用的化感物质肉桂酸和对羟基苯甲酸降解效果好的菌种。主要得到以下结果:1对温室连作黄瓜根区根表土壤微生物区系研究表明:①连作黄瓜根区土壤细菌数量大幅度下降、真菌数量大幅度增加,其中病株细菌数量较健株减少16.9%,真菌数量增加56.1%;病株根区病原真菌茄病镰刀菌(Fusarium solani)及尖孢枝孢菌(Cladosporium oxysporum)的数量分别较健株增加了366.15%和2201.85%;B/F、A/F值病株较健株分别降低了46.8%和36.8%,微生物由“细菌型”向“真菌型”过渡。②黄瓜根系染病溃烂导致黄瓜根表土壤细菌、真菌和放线菌数量急剧增加,病株根表细菌、真菌及放线菌数量分别是健株的56.3倍、7.9倍及2.7倍。③黄瓜病健株根区土壤养分存在差异,病株根区速效磷钾含量较健株低,说明速效磷钾含量与黄瓜枯萎病发生有一定关系。对优势菌通过形态和分子手段鉴定最终为:B1为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),B3为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis),F1为茄病镰刀菌(Fusarium solani),F2为毛壳属菌(Chaetomium),F4为尖孢枝孢(Cladosporium oxysporum),F7为波兰青霉(Penicillium.polonicum),F9为甜瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. Melonis),F11为刀孢轮枝菌(Lecanicillium psalliotae),A1为绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes),A3为多产色链霉菌(Streptomyces polychromogenes),A4为加德那链霉菌(Streptomyces gardneri),A 5为高加索山链霉菌(Streptomyces ciscaucasicu)。2对研究室筛选的3株优秀放线菌对黄瓜枯萎病防治研究表明:拮抗和机理试验表明:拮抗试验表明,3株放线菌对2种病原菌都有拮抗作用,而且拮抗性强弱为Act12>Act11>Act1,其中Act12的拮抗性效果最好;抑菌试验表明,3株放线菌发酵液对黄瓜枯萎病病原菌生长具有抑制作用,抑菌强弱也表现为Act12>Act11>Act1。并且发现不同浓度的发酵液对黄瓜的发芽率几乎没有影响,但是对胚根的生长有明显的促进作用。对3株放线菌发酵液的活性物质进行HPLC测定,结果表明,放线菌Act12、Act11的指纹色谱比较相近,而且通过与生长素、细胞分裂素和赤霉素3种生长因子的色谱图比较,可以发现,3种放线菌都含有这些物质,这为3株放线菌能够促进黄瓜生长和抑制枯萎病提供了理论基础。盆栽试验研究了3种生防放线菌剂单接和与病原菌混接对黄瓜的促生作用及对黄瓜叶片PPO酶活性的影响。结果表明:①供试放线菌制剂对黄瓜幼苗有显著的促生作用,在接种量为1.5 g/kg、20d时,菌剂Act12(密旋链霉菌,Streptomyces pactum)单独接种处理后,黄瓜植株总重量、根系鲜重、根系长度、根系活力及叶面积分别较对照CK提高18.8 %、225.0 %、57.3 %、482.0 %及45.3 %;Act12与黄瓜枯萎菌HK混合接种时,其各对应指标测值分别较对照HK提高78.9 %、114.6 %、162.6 %、443.4 %及50.0 %。②施用菌剂后对叶片诱导酶PPO活性有一定提高,45d时,单接Act12(1.50 g/kg)较对照增加了54.4 %。③接种放线菌剂对黄瓜幼苗叶片绿色度SPDA无明显影响。大田试验研究了生防菌剂Act11和Act12结合有机肥,通过育苗和定植两种试验方案对连作黄瓜的影响,为应用放线菌剂防治黄瓜连作障碍提供理论依据。结果表明,黄瓜生长前期:向营养基质中接种ARMER或移栽时穴施接种ARMER及育苗移栽两次接种ARMER可以显著促进黄瓜幼苗生长,提高产量和黄瓜Vc含量,改善连作黄瓜的生长状况,对霜霉病也有一定控制作用,有机肥与ARMER混合使用也有类似效果;黄瓜的生物量、主蔓长度、单节长度、结果数和产量几乎都明显大于对照,尤其对黄瓜的根部生长有明显的促进作用,而且在生长后期有机肥施用后作用更加明显,施入菌剂处理后,黄瓜根区、根表内的微生物区系组成正常,处于健康状态。3新的拮抗放线菌的筛选研究表明:通过拮抗试验从600多株放线菌中筛选出72株拮抗效果较好的放线菌,在此基础上通过抑菌率试验筛选出12株放线菌,其中对黄瓜枯萎病的中的其中一株(从黄瓜枯萎病病株中分离的,已经过分子鉴定),效果突出,放线菌编号为D141,拮抗试验中D141对病原菌的抑菌圈直径达21mm;生长速率法试验中,D141无菌发酵液的抑菌作用最强,在72 h内抑菌率保持在92 %以上;搭片试验也表明D141对病原菌菌丝具有溶解作用。经过生理生化试验和分子鉴定确定为:球孢链霉菌球孢亚种(Streptomyces globisporus subsp. globisporus)。编号为D220,D154和D141的3株放线菌,对黄瓜枯萎病两种病原菌效果均明显,而且是从连作黄瓜土壤中分离出的,具有很好的开发利用前景。经过菌落形态、生理生化、C源利用和分子鉴定最终确定此3株菌分别为:D220为绿淀粉酶链霉菌(Streptomyces viridodiastaticus),D154为孔雀石刺链霉菌(Streptomycesmalachitospinus),D141为球孢链霉菌球孢亚种(S. globisporus subsp. globisporus)。4黄瓜化感物质降解菌的筛选试验表明:以对羟基苯甲酸和肉桂酸作为黄瓜的2种主要化感物质,筛选对黄瓜化感物质具有降解能力的优良菌。结果表明:不同浓度的对羟基苯甲酸和肉桂酸对黄瓜枯萎病病原菌生长都有促进作用。其中菌株49、D163、ZY114和8的对对羟基苯甲酸和肉桂酸的降解能力比较好,尤其是两种酚酸类物质在浓度较高时,降解率达到90%左右。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 黄瓜连作障碍的原因
• 1.1.1 土壤养分不平衡
• 1.1.2 土壤生物学环境恶化
• 1.1.3 化感作用
• 1.2 黄瓜枯萎病及其病原菌
• 1.2.1 黄瓜枯萎病发生及性状表现
• 1.2.2 黄瓜枯萎病病原菌
• 1.3 黄瓜连作障碍治理
• 1.3.1 选育抗病品种
• 1.3.2 农业防治
• 1.3.3 化学防治
• 1.3.4 生物防治
• 1.4 拮抗微生物防治连作障碍的作用机理
• 1.4.1 直接作用
• 1.4.2 间接作用
• 1.5 研究目的、意义及技术路线
• 1.5.1 研究目的和意义
• 1.5.2 技术路线
• 第二章 连作黄瓜枯萎病株、健株根域土壤微生物生态研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 黄瓜病株、健株的生物学性状
• 2.2.2 黄瓜病株、健株根区土的理化性质
• 2.2.3 黄瓜病株、健株根区土和根表土微生物区系
• 2.2.4 优势菌的分子鉴定结果
• 2.2.5 优势菌的形态鉴定结果
• 2.2.6 黄瓜病株、健株根区土和根表土中的优势微生物
• 2.2.7 黄瓜根系土壤中优势细菌、真菌和放线菌的拮抗性
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 3 株放线菌发酵液对黄瓜尖孢镰刀菌的拮抗及对黄瓜的促生活性
• 3.1 试验材料和方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 拮抗效果
• 3.2.2 放线菌无菌发酵液对黄瓜枯萎菌抑菌率测定
• 3.2.3 放线菌无菌发酵液对黄瓜发芽率和胚根长度的影响
• 3.2.4 放线菌发酵液成分HPLC 指纹图谱
• 3.3 讨论
• 第四章 放线菌剂对黄瓜幼苗生长及叶片PPO 活性的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 促生作用
• 4.2.2 生防菌剂对黄瓜诱导抗性的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 放线菌剂对连作温室黄瓜生长及产量品质的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 黄瓜苗期生物量
• 5.2.2 黄瓜生长期
• 5.3 讨论
• 第六章 放线菌剂和有机肥对黄瓜生长及根区根表土壤微生物区系的影响
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 收获期黄瓜的生物学性状
• 6.2.2 黄瓜收获期根部性状
• 6.2.3 不同处理后黄瓜根区、根表的微生物区系
• 6.3 讨论
• 第七章 黄瓜枯萎病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 试验方法
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 放线菌对尖孢镰刀菌的皿内拮抗作用
• 7.2.2 放线菌无菌发酵滤液对尖孢镰刀菌的抑制作用
• 7.2.3 放线菌对尖孢镰刀菌菌丝形态的作用
• 7.2.4 菌株D141 的分类地位
• 7.3 讨论
• 第八章 3 株筛选自黄瓜根区土壤抗黄瓜枯萎菌放线菌的拮抗性及其鉴定
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 方法
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 拮抗效果
• 8.2.2 放线菌无菌发酵液对黄瓜枯萎菌抑菌率
• 8.2.3 放线菌对黄瓜枯萎菌菌丝的作用
• 8.2.4 3 株放线菌的菌落形态
• 8.2.5 放线菌生理生化性质测定
• 8.2.6 3 株放线菌分子鉴定
• 8.3 讨论
• 第九章 黄瓜化感物质降解菌筛选
• 9.1 试验材料与方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 方法
• 9.2 结果与分析
• 9.2.1 化感物质对病原菌菌丝生长的影响
• 9.2.2 化感物质降解菌筛选
• 9.3 结果与讨论
• 第十章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介