高糖对肾小球系膜细胞氧化应激和增殖的影响及白藜芦醇的干预机制研究&通络方剂对高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞体外增殖作用和氧化应激的影响

论文摘要

近年来越来越多的证据提示,高糖介导的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶活性增高引起的氧化应激反应对糖尿病微血管并发症的病情发展起着重要作用。NADPH氧化酶最初在吞噬细胞中发现,近年来的研究显示,许多非吞噬细胞中的NADPH氧化酶是活性氧（ROS）的主要来源,尤其在细胞因子、高糖、高脂等作用下可以产生更高水平的ROS。白藜芦醇（Resveratrol）是一种常见于葡萄、虎杖等植物中的一种多酚类化合物,目前的研究显示它具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎以及延缓衰老等多种药理功能。糖尿病动物模型显示白藜芦醇对糖尿病微血管并发症有显著的保护作用。但白藜芦醇对高糖介导的肾小球系膜细胞NADPH氧化酶的激活和ROS的产生是否有保护作用仍不清楚。本课题在体外和体内水平研究了白藜芦醇在高糖所致肾小球系膜细胞损伤中的保护作用以及对NADPH氧化酶的影响。我们在标准糖浓度下（5.6mM）体外培养大鼠肾小球系膜细胞系（RMC）和原代提取的大鼠肾小球系膜细胞,高糖（25 mM）刺激细胞,用H2DCF-DA、MTT、BrdU掺入及化学发光法检测高糖下肾小球系膜细胞氧化应激水平、细胞活性、细胞增殖及NADPH氧化酶活性。Real-time PCR和Western blot分别在mRNA、蛋白水平检测高糖刺激下NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox表达情况。结果发现高糖刺激下肾小球系膜细胞氧化应激水平显著增加,细胞活性增加,细胞增殖。同时NADPH氧化酶活性增加,其亚基p22phox、p47phox基因表达增加,蛋白水平升高。ROS抑制剂N-acetyl-cysteine （NAC）、NADPH氧化酶抑制剂香草乙酮（apocynin）及白藜芦醇能同时降低高糖刺激下肾小球系膜细胞氧化应激水平和增殖;白藜芦醇同时降低NADPH氧化酶活性,降低p22phox、p47phox mRNA和蛋白水平。实验同时证实高糖能激活JNK-NF-κB信号通路,JNK抑制剂SP600125、NF-κB抑制剂sulfasalazine及显性负性突变体IκB（Dominant negative IκB）能显著抑制高糖下p22phox、p47phox亚基的蛋白水平升高,而白藜芦醇也能抑制高糖条件下JNK的磷酸化和NF-κB的激活,提示白藜芦醇作用于NADPH氧化酶可能与JNK-NF-κB通路相关。上述结果提示NADPH氧化酶介导了高糖引起的肾小球系膜细胞氧化应激反应,白藜芦醇能通过抑制NADPH氧化酶p22phox、p47phox的蛋白表达从而抑制NADPH氧化酶活性,在糖尿病微血管病变中发挥保护作用。采用体外培养大鼠肾小球系膜细胞（rat mesangial cells, RMCs）,MTT法检测RMCs增殖,DCFH-DA探针检测活性氧（ROS）生成,RT-PCR和Western blot检测铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物（Gpx）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和纤维连接蛋白（FN） mRNA和蛋白表达,探讨不同浓度通络方剂对高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞（RMCs）体外增殖作用和氧化应激的影响。结果提示高糖条件下,通络方剂可抑制RMCs增殖（P<0.05）,抑制活性氧生成（P<0.05）,该抑制作用呈浓度依赖模式;高糖作用于RMC后,MnSOD和FN mRNA和蛋白水平升高,通络方剂可抑制高糖条件下FN mRNA的升高和提高正常糖浓度条件下MnSOD蛋白水平,浓度依赖性地抑制高糖条件下FN蛋白的表达。因此,通络方剂可抑制高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞增殖,抑制氧自由基生成,提高抗氧化酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 高糖对肾小球系膜细胞氧化应激和增殖的影响及白藜芦醇的干预机制研究
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞系、实验动物和质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.2.1 试剂来源
• 2.1.2.2 试剂配方
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 大鼠肾小球系膜细胞的分离和培养
• 2.2.2 细胞培养
• 2.2.3 细胞及原代肾小球系膜细胞总 RNA 提取及纯化
• 2.2.4 逆转录与实时定量 PCR
• 2.2.5 细胞活力检测
• 2.2.6 细胞内氧自由基检测
• 2.2.7 细胞增殖检测
• 2.2.8 Westen 免疫印迹
• 2.2.9 NADPH 氧化酶活性检测
• 2.2.10 瞬时转染
• 2.2.11 统计学分析
• 3 实验结果
• 3.1 高糖通过 NADPH 氧化酶介导的活性氧的生成促进肾小球系膜细胞增殖
• phox和p47^phox然后激活NADPH氧化酶和活性氧促进RMC增殖'>3.2 高糖通过上调NADPH 氧化酶亚基p22^phox和p47^phox然后激活NADPH氧化酶和活性氧促进RMC增殖
• phox和p47^pho刺激纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）和 IV 型胶原（Collagen IV, Cog IV）的表达增加'>3.3 高糖通过NADPH氧化酶亚基p22^phox和p47^pho刺激纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）和 IV 型胶原（Collagen IV, Cog IV）的表达增加
• 3.4 白藜芦醇对高糖条件下 RMC 增殖和氧化应激的作用
• 3.5 高糖通过p-JNK-NF-κB 信号转导通路介导p22/p47 的表达
• 3.6 白藜芦醇抑制了 JNK 的磷酸化、IκBα的降解和磷酸化
• 4 讨论
• 5 参考文献
• 第二部分 通络方剂对高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞体外增殖作用和氧化应激的影响
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞培养
• 2.1.2 试剂
• 2.1.2.1 试剂来源
• 2.1.2.2 试剂配方
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 大鼠肾小球系膜细胞系的培养
• 2.2.2 细胞及原代肾小球系膜细胞总 RNA 提取及纯化
• 2.2.3 逆转录与 RT-PCR
• 2.2.4 细胞活力检测
• 2.2.5 细胞内氧自由基检测
• 2.2.6 Westen 免疫印迹
• 2.2.7 统计学分析
• 3 实验结果
• 3.1 通络方剂可浓度依赖性地抑制高糖条件下的肾小球系膜细胞增殖
• 3.2 通络方剂可浓度依赖性地抑制高糖条件下的肾小球系膜细胞活性氧的生成
• 3.3 通络方剂可浓度依赖性地降低高糖条件下纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）的基因表达
• 3.4 通络方剂可浓度依赖性地升高高糖条件下纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）的蛋白表达，升高低糖条件下锰超氧化物歧化酶（MnSOD）的蛋白表达
• 4 讨论
• 5 参考文献
• 综述：糖尿病肾病与氧化应激
• 参考文献
• 附录
• 发表论文
• 致谢