一株赖氨酸产生菌的菌种鉴定及发酵条件优化

论文摘要

赖氨酸是一种脂肪族碱性氨基酸,化学名称为2,6—二氨基己酸,广泛存在于酪蛋白、卵蛋白、纤维素蛋白等蛋白质的水解物,人和动物体内不能自身合成,是八种必需氨基酸之一。它对调节体内代谢平衡,提高体内对谷类蛋白质的吸收,改善人类膳食营养和动物营养,促进生长发育均有重要作用。目前被广泛地应用于医药、食品和饲料等领域。L-赖氨酸的制备方法主要为微生物发酵法,即以淀粉或淀粉糖为原料,由微生物在高浓度条件下发酵后制得。L-赖氨酸高产Ly-H6U79-Z8是本研究室从长白山温泉附近的泥土中筛选出的那高温L-赖氨酸产生菌,经过多次化学、物理诱变处理和遗传稳定性试验,获得一株稳定的具有耐高温、耐高糖、抗赖氨酸结构类似物、苏氨酸营养缺陷型的代谢特点,本研究旨在对它进行菌种鉴定及发酵条件的优化,以进一步提高其赖氨酸产量。菌种鉴定方面,采用表型与遗传学鉴定相结合的方法。通过形态学观察Ly-H6U79-Z8为G-杆菌,无荚膜,无芽孢,运动,兼性厌氧菌,属肠杆菌。理生化特征鉴定以《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版、第九版）和《常见细菌鉴定手册》为依据,选取20项特征进行试验。将结果与肠杆菌科中的12个菌属特征进行比较,无一完全对应,但与埃希氏菌属、爱德华氏菌属、柠檬酸细菌属、耶尔森氏细菌属、欧文氏菌属相似性较高,不同特征为2～3处。将结果与肠杆菌科各属的模式株比较,该菌与中间耶尔森氏菌和大肠埃希氏菌相近。即表型鉴定结果为该菌可能属于肠杆菌科的中间耶尔森氏菌属或埃希氏菌属。遗传学鉴定采用16S rDNA序列分析方法。提取测定Ly-H6U79-Z8 16S rDNA的基因序列,并将其登录到基因库中进行同源性比对,共搜索出178个与其同源性较高的基因序列,通过绘制系统进化树,最终鉴定Ly-H6U79-Z8属于肠杆菌科,埃希氏菌属中与大肠埃希氏菌种亲缘非常近的一个新菌种。该结果与表型鉴定结果吻合。发酵条件优化方面,本研究主要是从培养基和发酵参数两方面进行优化,以达到高产目的。首先采用单因素试验从碳源、氮源、无机盐、种子质量、温度、pH、发酵时间等可以用于发酵生产赖氨酸的营养基质和发酵条件中筛选影响赖氨酸产量的关键因素。然后采用正交试验分别对营养基质和发酵条件中各因素之间的关系进行评价,得到最佳营养基质和发酵条件,并用SPSS统计软件进行结果分析。最后确立高产赖氨酸Ly-H6U79-Z8的培养条件为:最适碳源是葡萄糖,初始葡萄糖浓度为20%;最适氮源为硫酸氨、玉米浆,初始浓度为5%硫酸氨、4%玉米浆;最适无机盐为MgSO4·7H2O 0.05%,K2HPO40.1%,CaCO3 5.5%;最适环境因子为苏氨酸0.04%,蛋氨酸0.03%,生物素400μg/L;最佳培养温度为37℃;发酵时间（发酵周期）为48h;初始培养基pH为7;接种量为10%（接种时间为12h,OD值为1.2）。经上述条件培养后发酵液中赖氨酸含量为79.9 g/L。在同等条件下处于先进水平。目前,赖氨酸的生产菌种主要集中在谷氨酸棒杆菌、金色短杆菌、以及酵母等一些发酵温度为30℃的菌种上,30℃是大部分细菌、噬菌体、病毒生存的最适温度,这就使这些菌种在发酵过程中极易感染杂菌,严重影响生产水平。而Ly-H6U79-Z8为耐高温菌,发酵温度可达到37～39℃,这就极大降低了生产过程中杂菌污染的可能性,避免了产量不稳定、倒罐等影响,很大程度地提高了生产水平,降低了生产成本。因此对Ly-H6U79-Z8的研究与应用推广,可极大的推动赖氨酸工业的发展及赖氨酸的广泛应用,对提高农畜产品的质量和推动功能性食品、医药行业的发展有重要意义,从而有效提高人们的健康水平。同时通过采用生物技术的方法,可以加速吉林省玉米的高值转化,为吉林省的农产品加工开辟出一条新途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 赖氨酸的性质、营养特性及应用需求现状
• 1.1.1 赖氨酸的性质
• 1.1.2 L-赖氨酸的应用需求现状
• 1.2 国内外生产L-赖氨酸的研究进展
• 1.2.1 L-赖氨酸的生产方法
• 1.2.2 发酵法生产L-赖氨酸的的研究进展
• 1.2.3 发酵工艺条件优化的意义
• 1.3 细菌菌种鉴定的的研究进展
• 1.3.1 细菌分类系统
• 1.3.2 细菌菌种鉴定的方法
• 1.3.3 16S rDNA序列同源性分析
• 1.3.4 分子生物学鉴定与传统生理生化鉴定相结合的意义
• 1.4 本研究的内容和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 仪器设备
• 2.2 试验材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 引物
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 形态学特征观察
• 2.3.2 Ly-H6U79-Z8的生理生化特征测定
• 2.3.3 Ly-H6U79-Z8的16S rDNA序列同源性和系统发育分析
• 2.3.4 含量检测
• 2.3.5 发酵条件优化
• 第三章 结果与分析
• 3.1 菌种鉴定
• 3.1.1 形态学特征
• 3.1.2 生理生化特征
• 3.1.3 Ly-H6U79-Z8的16S rDNA序列同源性和系统发育分析
• 3.2 含量测定
• 3.2.1 赖氨酸标准曲线
• 3.2.2 葡萄糖标准曲线
• 3.3 发酵条件优化
• 3.3.1 碳源的影响
• 3.3.2 氮源的影响
• 3.3.3 无机盐的影响
• 3.3.4 环境因子的影响
• 3.3.5 种子质量的影响
• 3.3.6 温度对产赖氨酸的影响
• 3.3.7 初始pH对产赖氨酸的影响
• 3.3.8 发酵时间对产赖氨酸的影响
• 3.3.9 正交试验结果分析
• 3.4 赖氨酸含量测定
• 3.4.1 TLC法测定
• 3.5 讨论
• 3.5.1 菌种鉴定
• 3.5.2 Ly-H6U79-Z8产赖氨酸的发酵条件的优化
• 3.5.3 研究比较
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.1.1 菌种鉴定
• 4.1.2 发酵条件优化
• 4.2 展望
• 4.2.1 高产赖氨酸菌种选育
• 4.2.2 发酵生产
• 参考文献
• 附录一:菌株Ly-U9H6-Z8 PCR扩增的16S rDNA序列
• 附录二:试剂
• 附录三:鉴定培养基配置及贮存
• 致谢
• 作者简介