棉花促丝裂原活化蛋白激酶（GhMAPK）基因的分离与功能分析

论文摘要

促丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。MAPK级联途径（MAPKKK-MAPKK-MAPK）通过依次磷酸化传递环境信号,参与植物生长发育和多种生物、非生物胁迫信号转导。近年来许多研究发现MAPK与植物病原信号传递关系相当密切,并鉴定多种受病原侵染诱导的MAPK。棉花是一种重要的经济作物,利用基因工程方法培育棉花抗病新品种已经成为棉花育种的研究热点。本文以鲁棉22为材料,首次从棉花中克隆了MAPK基因（GhMAPK）,并对其进行了序列比对,表达特性分析及功能鉴定。具体结果如下:1.根据同源序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从棉花（Gossypium hirsutum）中克隆到一个MAPK基因,命名为GhMAPK。GenBank注册号为DQ132852。其cDNA全长为1832bp,编码一个372氨基酸蛋白质。序列分析发现GhMAPK具有蛋白激酶所保守的11个亚区和TEY特征磷酸化位点。与C组MAPK同源性最高,同来自于拟南芥、杏、矮牵牛、豌豆、烟草中的几种MAPK同源性高达83-89%。cDNA序列与基因组序列比较后发现GhMAPK基因组序列内存在两个内含子。2.Southern杂交说明在棉花基因组中可能存在多个与GhMAPK具有一定同源性的其他MAPK基因,或者可以说存在一个小的MAPK基因家族。Northern杂交发现GhMAPK转录水平受机械损伤,高盐,冷害等非生物胁迫诱导而提高;植物抗病反应相关信号分子SA和H2O2也能诱导GhMAPK表达;棉花幼苗接种棉花枯萎病菌后,GhMAPK表达量也有明显提高,进一步证明了GhMAPK参与了病原侵染反应过程。3.将GhMAPK构建了正义植物表达载体pBI121-GhMAPK,采用农杆菌介导的方法,转化烟草（NC89）,同时转空载体为对照。经卡那霉素筛选获得若干再生植株。经过PCR鉴定,并选取部分转基因植株进行了Northern和Western杂交分析,结果证明GhMAPK在转基因烟草中已成功得到表达。4.选取两个T0代转基因株系的自交种子扩繁,得到T1代转基因植株。在分子鉴定基础上,对T1代转基因植株进行了生物学功能分析。抗真菌实验中,接种了黑胫病原菌（Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker）的转基因植株的抗病能力明显高于对照植株。烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）侵染后,ELISA检测的结果表明,转基因植株中有部分株系表现出了明显的抗病性,但数量很少,大部分表现为感病,病毒抗性植株仅占接病总株数的约10%。5.构建原核表达载体pET- GhMAPK,并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达融合蛋白,将特异诱导带切下,溶于PBS中获得抗原,免疫小鼠,其抗血清效价为1﹕1000。

论文目录

• 英文缩写符号及其中英文对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 植物细胞信号转导
• 1.2 蛋白质的可逆磷酸化与蛋白激酶
• 1.3 植物中的MAPK
• 1.3.1 MAPK 级联系统
• 1.3.2 植物中MAPK 的结构特点
• 1.3.3 植物中MAPK 的种类
• 1.3.4 植物中MAPK 的功能
• 1.3.4.1 MAPK 与干旱、高盐和低温胁迫信号传递
• 1.3.4.2 MAPK 与植物机械损伤信号传递
• 1.3.4.3 MAPK 与植物病原信号传递
• 1.3.4.4 MAPK 与植物生长发育
• 1.3.4.5 MAPK 与植物激素信号传递
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶与各种生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA 提取
• 2.2.1.1 利用RNeasy Plant Mini Kit 提取总RNA
• 2.2.1.2 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA
• 2.2.2 cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 cDNA 回收纯化
• 2.2.4 cDNA 的5′加尾反应
• 2.2.5 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.5.1 简并引物PCR 获得GhMAPK 中间片段
• 2.2.5.2 5′RACE 获得5′端序列
• 2.2.5.3 3′RACE 获得3′端序列
• 2.2.5.4 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.5.5 GhMAPK 全长基因组序列的获得
• 2.2.6 目的片段的回收
• 2.2.7 目的片段与克隆载体的连接
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.10 质粒DNA 的提取
• 2.2.10.1 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.10.2 大量法提取质粒DNA
• 2.2.10.3 试剂盒质粒微量提取方案
• 2.2.11 对重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.12 Northern 杂交
• 2.2.12.1 RNA 提取
• 2.2.12.2 琼脂糖甲醛变性胶电泳
• 2.2.12.3 转膜及烘膜
• 2.2.12.4 探针合成
• 2.2.12.5 预杂交及杂交
• 2.2.13 Southern 杂交
• 2.2.13.1 基因组DNA 的提取
• 2.2.13.2 限制性内切酶消化
• 2.2.13.3 转膜
• 2.2.13.4 探针合成
• 2.2.13.5 预杂交及杂交
• 2.2.14 植物表达载体的构建与转化
• 2.2.14.1 植物正义表达载体的构建
• 2.2.14.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.14.3 冻融法转化农杆菌
• 2.2.14.4 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.15 原核表达及抗体制备
• 2.2.15.1 试剂配制
• 2.2.15.2 原核表达载体的构建
• 2.2.15.3 大肠杆菌BL21 原核表达的诱导
• 2.2.15.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.15.5 抗体的制备
• 2.2.15.6 抗血清效价的测定
• 2.2.16 Western 杂交
• 2.2.16.1 烟草叶片总蛋白质的提取
• 2.2.16.2 半干法蛋白转移
• 2.2.16.3 免疫检测
• 2.2.16.4 显色法检测蛋白质
• 2.2.17 病毒含量的ELISA 检测
• 3. 结果与分析
• 3.1 棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的分离
• 3.1.1 棉花RNA 的提取及反转录
• 3.1.2 GhMAPK 中间片段的分离
• 3.1.3 GhMAPK 5′片段的分离
• 3.1.4 GhMAPK 3′片段的分离
• 3.1.5 GhMAPK 全长cDNA 的分离
• 3.2 GhMAPK 的序列分析
• 3.2.1 GhMAPK 的全长cDNA 分析
• 3.2.2 GhMAPK 编码蛋白序列分析
• 3.2.3 GhMAPK 预测蛋白的跨膜结构分析
• 3.2.4 GhMAPK 基因组序列分析
• 3.3 GhMAPK 在棉花基因组中的拷贝数分析
• 3.4 GhMAPK 的表达特性分析
• 3.4.1 非生物胁迫下GhMAPK mRNA 水平的变化
• 3.4.2 信号分子对GhMAPK mRNA 水平的影响
• 3.4.3 生物胁迫下GhMAPK mRNA 的积累
• 3.5 GhMAPK 基因的原核诱导表达及抗体制备
• 3.6 GhMAPK 基因在烟草中的超表达及转基因烟草的抗性鉴定
• 3.6.1 转基因烟草表达载体的构建
• 3.6.2 T0 代转基因植株的鉴定
• 3.6.2.1 转基因植株的PCR 鉴定
• 3.6.2.2 转基因植株的Northern 杂交
• 3.6.2.3 转基因植株的Western 杂交
• 3.6.3 T1 代转基因植株的鉴定及转基因植株的抗性分析
• 3.6.3.1 T1 代转基因植株的PCR 鉴定
• 3.6.3.2 病毒抗性分析
• 3.6.3.3 真菌抗性分析
• 3.6.3.4 GhMAPK 过表达烟草抗性机制的初步推测及下步计划
• 4 讨论
• 4.1 GhMAPK 属于C 组MAPK 家族
• 4.2 GhMAPK 受多种环境胁迫诱导
• 4.3 GhMAPK 对转基因烟草抗性的作用
• 5 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 附: 硕士阶段已发表论文