论文摘要
对于鸡球虫病的预防和治疗,传统是采取活卵囊预防和药物防治的方法,主要依赖药物防治。这些措施存在诸多的问题亟待解决。开发新的防治方法,需要对病原做更深入的研究。鸡球虫表面抗原是现阶段研究热点之一。柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG21和SAG23基因是Fiona Tomley等人对柔嫩艾美耳球虫的大量的表达序列标签（Expressed sequene tags ESTs）作分析后,鉴定出的两个表面抗原基因。本研究克隆了柔嫩艾美耳球虫（广东株）SAG21和SAG23基因。一方面,将SAG21和SAG23基因进行原核表达,制备基因工程重组蛋白;另一方面将SAG21和SAG23基因分别克隆至真核表达载体pcDNA6.0（c）,制备重组真核表达质粒。用制备的重组蛋白和重组质粒免疫鸡,对免疫鸡进行攻虫,评价其保护效力。具体实验分为以下几部分:SAG21和SAG23基因的克隆、鉴定及序列分析根据发表在GenBank上的SAG21和SAG23基因序列,利用Primer primer 5.0软件各设计了一对引物,从E.tenella第二代裂殖子中提取总RNA,应用RT-PCR技术克隆出相应基因并与pGEM-T载体连接,经PRC鉴定和DNA测序证实克隆到目的基因。基因序列分析结果表明,SAG21基因完整开放阅读框全长810 bp,编码269个氨基酸;SAG23基因完整开放阅读框全长813 bp,编码270个氨基酸。与已发表的豪顿株的序列相比,核苷酸序列以及推导的氨基酸序列相似性均达99.6%以上。对所克隆的基因进行信号肽分析,两基因的1—75位核苷酸为信号肽编码序列。根据分析结果,克隆了不含N端疏水性信号肽序列SAG21、SAG23基因。SAG21和SAG23基因在大肠杆菌中的表达及纯化.将不含N端疏水性信号肽编码序列的SAG21、SAG23基因克隆至原核表达载体pMAL-c2X中并转化入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-APGE电泳显示,重组载体均表达目的蛋白,表达的重组蛋白的分子量均为68KDa左右,与推导的氨基酸序列的大小相符。IPTG诱导菌经超声波裂解破碎,SDS-PAGE结果表明,大部分表达产物在裂解液上清中。按pMAL-c2X表达系统纯化操作手册,经Amylose Resin层析获得较高浓度的纯化重组蛋白。Western blotting结果表明,鸡抗柔嫩艾美耳球虫高免血清能检测到纯化的重组蛋白。SAG21和sAG23基因的重组真核表达质粒的制备及其在鸡体内表达的检测利用重组DNA技术,构建pcDNA6（c）-SAG21、pcDNA6（c）-SAG23重组质粒。通过限制性内切酶酶切和DNA测序,证明重组质粒构建成功。将制备的重组质粒按100μg/羽免疫14日龄鸡。免疫后8天取注射部位肌肉、非注射部位肌肉,用RT-PCR和Westem-blot检测SAG21和SAG23基因的转录与表达。结果表明,目的基因在鸡体内成功转录和表达,重组质粒构建成功。重组蛋白和重组真核表达质粒的动物免疫保护试验用制备的SAG21、SAG23重组蛋白和pcDNA6（c）-SAG21、pcDNA6（c）-SAG23重组质粒,按实验设计方案,于14日龄、21日龄两次经胸部肌肉注射免疫雏鸡,28日龄经口感染3×104新鲜的柔嫩艾美耳球虫卵囊。35日龄扑杀鸡,分别作相对增重率、盲肠病变计分、盲肠内容物卵囊数等几个指标,判定重组蛋白和重组质粒的保护效力。结果表明,重组蛋白和重组质粒能降低卵囊产量,减轻盲肠病变。其中,重组质粒保护效果优于重组蛋白,高剂量重组蛋白混合使用免疫效果优于单个重组蛋白免疫效果。
论文目录
相关论文文献
标签：基因论文; 重组蛋白论文; 重组真核表达质粒论文;