大黄素联合顺铂对食管癌EC-9706细胞增殖的影响

论文摘要

背景及目的传统化疗药顺铂（Cisplatin,DDP）在肿瘤治疗过程中,由于耐药性、剧烈恶心、呕吐等毒副作用限制了广泛应用,一直以来,科研工作者也在寻求具有抗肿瘤活性且耐受性好的天然药物。大黄素（Emodin,EM）作为天然的蒽醌类化合物,因其具有抗肿瘤活性而倍受关注,其抗肿瘤机制包括抑制肿瘤细胞增殖、吸附和转移,诱导凋亡和抑制体内肿瘤相关血管的生成。在肿瘤细胞凋亡过程中,活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）是作为早期信号,作用于线粒体后使线粒体通透性改变而出现功能障碍,使线粒体Bcl -2含量下降、Bax含量增加、释放细胞色素C,激活Caspase - 2,- 3,- 9,引起细胞凋亡。另外,损伤的线粒体可进一步产生ROS,加速细胞凋亡。在蒽醌类介导的细胞凋亡过程中,ROS发挥了重要作用,目前认为ROS是致细胞凋亡过程中最常见的生物活性因子, ROS的产生是许多化疗制剂发挥作用的重要模式,ROS产物的增加可致氧化失衡,这是细胞凋亡发生的共同中间环节。大黄素结构与二甲萘醌及线粒体的泛醌类似,二甲萘醌是内源性ROS生成剂,泛醌是线粒体产生ROS的主要来源,是一种安全的ROS生成剂,能明显升高肿瘤细胞内活性氧水平,提高对化疗药物的敏感性。本实验旨在通过活性氧内源性生成剂大黄素,联合顺铂对人食管癌EC-9706细胞增值的影响,为大黄素联合化疗药物的抗肿瘤作用提供理论依据。材料和方法1.用含10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养人食管癌细胞株EC-9706细胞。2.用含不同药物的培养基,Emodin组:30μg/ml大黄素溶液,DDP组:5μg/ml DDP溶液,Combined组:30μg/ml大黄素+5μg/ml DDP溶液作用于EC-9706细胞12h、24h和48h,以培养基未加细胞及药物为调零组、未加药物处理细胞为对照组。3. AO/EB法检测不同药物组分别作用于EC-9706细胞12h、24h和48h后细胞的形态学变化,记录细胞内染料进入情况,并记录各期细胞凋亡情况。4.噻唑蓝比色法（ MTT法）检测不同药物组分别作用于EC-9706细胞12h、24h和48h后,对细胞的增殖及抑制情况的影响,并计算两药之间是否存在协同作用。5.流式细胞分析仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡情况,不同组药物分别作用于EC-9706细胞24h后,用Annexin V - FITC/PI双染法测检测EC-9706细胞凋亡情况。6.流式细胞分析仪检测细胞内活性氧含量,不同组药物分别作用于EC-9706细胞2h后,用活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）检测细胞内活性氧含量。结果1. AO/EB法结果显示,对照组细胞生长良好,细胞膜完整性良好,荧光显微镜下,细胞内基本上为绿色荧光,几乎见不到橘红色荧光,大黄素组和顺铂组可见少量橘红色荧光,与大黄素联合顺铂组相比,荧光明显弱于单药的大黄素、顺铂组,结果提示,联合组具有明显的抑制肿瘤EC-9706细胞增殖、促进细胞凋亡作用。2. MTT法示:随着作用时间的延长,大黄素组、顺铂组和大黄素联合顺铂组对细胞的抑制作用逐渐增强,作用12h、24h、48h后增殖率分别为58.35±5.03%、45.18±4.33%、40.24±7.71%和72.06±2.92%、56.60±6.41%、23.06±4.52%,联合组47.35±5.78%、37.29±4.85%、15.45±2.46%,二药联合时增殖率较单药更低（P<0.05）。12h、24h和48h的CDI值分别为0.94±0.03,0.91±0.04,0.90±0.03,结果示两药间存在协同效应。3.流式细胞术结果显示各组内出现不同程度的凋亡,大黄素、顺铂和二药联合分别作用EC9706细胞24h后,流式细胞术检测细胞早期凋亡率分别为15.39±3.40%, 12.80±2.41%和23.09±3.97%,对照组仅为0.43±1.04%,联合组与其他三组相比,P<0.05,差别具有统计学意义,随着作用时间的延长,调亡率也逐渐增加,大黄素联合顺铂较单药更具有促凋亡作用。4.流式细胞术检测细胞内活性氧有不同程度的升高,不同组药物分别作用EC-9706细胞2 h后,按试剂盒说明书步骤,收集细胞,用流式细胞术测定细胞内的荧光强度,荧光可以间接反映细胞内活性氧的含量,结果显示,不同组药物作用2h后,细胞内活性氧的含量分别为35.57±3.16%,29.44±2.43%和43.23±3.68%,对照组仅为4.73±2.12%,统计结果显示,P<0.05,差别具有统计学意义,提示联合作用组具有明显增加细胞内活性氧含量,促进细胞凋亡的作用。结论1.大黄素、顺铂能够抑制人食管癌EC-9706细胞增殖,促进其凋亡,并随着大黄素、顺铂作用时间的延长,抑制作用逐渐增强,二药联合与单药相比,更具有抑制细胞增殖,促进凋亡的作用,结果显示二药存在协同作用。2.与对照组相比,大黄素、顺铂均能提高EC-9706细胞内活性氧含量,结果显示大黄素、顺铂联合组能显著提高细胞内活性氧含量,促进肿瘤细胞凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词
• 第一章 前言
• 第二章 实验设计
• 第三章 材料和方法
• 第四章 实验结果
• 4.1 AO/EB 法观察EC-9706 细胞形态学变化
• 4.2 大黄素、顺铂具有抑制 EC-9706 细胞增殖的作用
• 4.3 大黄素、顺铂具有促进EC-9706 细胞凋亡作用
• 4.4 EC-9706 细胞内 ROS 含量
• 第五章 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 在学期间发表论文情况
• 致谢
• 个人简历