青岛近海附着细菌和养殖环境反硝化细菌多样性研究

论文摘要

海水中的附着细菌对自然界有机物的生成和分解、环境污染物的生物降解以及限制性营养物质的循环有着重要作用。附着细菌可能直接影响水产经济动物幼虫的附着,还参与生物腐蚀和生物污损,直接造成养殖业和海洋工程的经济损失。虽然附着细菌在生态环境中非常重要,但是人们对近海早期附着细菌群落结构和演替规律的了解还非常少。为了解青岛近海附着细菌多样性和群落演替特征,将浸海1至7天玻片上的附着细菌通过16S rRNA基因（16S rDNA）文库方法进行了研究。从三个基因文库中共筛选了269个克隆、144个有效分类操作单元（OTUs）并将其全部测序。16S rDNA序列系统进化分析发现细菌主要归属于8个细菌门类:变形菌门（Proteobacteria）（α-、γ-和δ-亚群）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、芽单胞菌门（ Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（ Firmicutes ）、浮霉菌门（Planctomycetes）、光合细菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）。由本研究结果可知一周内变形菌门的α-亚群、γ-亚群和拟杆菌门的细菌是常见的附着类群;α-变形菌亚群中的玫瑰杆菌族（Roseobacter clade）是海洋环境中比较常见的早期附着种类;由聚类分析显示3天和7天细菌的群落结构相似。这些实验结果为了解海水附着细菌生物膜形成的演替过程提供了理论基础,并为海水微生物腐蚀控制提供了生物学线索。水产养殖过程中,氮素积累日益严重,而其中亚硝酸盐和氨氮由于转化速度低,毒性强,对养殖的危害更加突出。反硝化细菌具有能将养殖环境中过多的氮排出进而保持全球氮循环流畅的能力,并且在维持养殖生态系统可持续发展中发挥着重要的作用。然而,目前为止人们对养殖环境中反硝化细菌所知甚少,为了解其反硝化细菌群落结构和多样性,本研究首次应用PCR-RFLP和测序分析法对海水养殖环境反硝化细菌功能基因（nirS）的多样性和系统发育进行了探讨。研究选用了养殖环境5个站位分别建亚硝酸盐还原酶基因（nirS）文库,经限制性片段长度多态性（RFLP）分析,在5个样品中共获得360个克隆,其中产生158个可操作分类单元（OTUs）,并将其全部测序分析。从这些序列分析中发现了一些比较新奇的菌类,这些菌类的nirS基因对应的氨基酸与数据库中可培养的反硝化细菌或来自其它环境的序列相似度都小于92%。系统进化分析发现,氨基酸序列可分成7个大簇,从养殖环境中所获得的序列大部分归在第一簇,并且只有少数的nirS序列和可培养的反硝化细菌聚在一个分支上;从系统发育树还可以看出,养殖环境沉积物中nirS序列之所以与世界其它环境的序列聚在一起,是由他们所处环境的相似程度决定的。另外研究还发现了这些反硝化细菌不同亚簇的形成可能是由很多环境因子共同作用的结果。这些研究发现可以帮助我们了解养殖环境反硝化细菌的分布规律以及寻找有益反硝化细菌,进而为微生态制剂的研制和养殖环境的生物修复提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第一节 近海附着细菌多样性研究进展
• 1.1 附着细菌多样性研究简史
• 1.2 细菌附着的分子生物学研究方法
• 1.3 附着细菌的主要类群
• 1.4 附着细菌与浮游细菌的关系
• 1.5 重要的附着类群 Rhodobacterales
• 1.6 附着细菌的演替规律
• 1.7 国内概况
• 1.8 附着细菌的研究建议
• 参考文献
• 第二节 养殖环境反硝化细菌的生态学研究进展
• 2.1 反硝化细菌的种类
• 2.2 反硝化细菌分子生物学研究方法
• 2.3 反硝化细菌分子生态学研究概况
• 2.4 水产养殖环境反硝化细菌的研究建议
• 参考文献
• 第三节 微生物生态学研究的主要方法
• 3.1 传统的微生物生态学研究方法
• 3.2 常用的分子微生物生态学研究方法
• 3.3 传统的生物生态学和分子生态学方法的比较
• 参考文献
• 第四节 本论文的思路、研究目的及意义
• 4.1 学术构想与思路
• 4.2 主要研究的内容
• 4.3 主要研究的意义
• 第二章 海水附着细菌多样性和群落演替的分子生物学研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料的采集
• 1.2 环境微生物总基因组DNA的提取
• 1.3 16S rDNA 的扩增
• 1.4 16S rDNA 基因文库的建立
• 1.5 扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）
• 1.6 数据分析
• 1.7 16S rDNA 序列分析
• 1.8 16S rDNA序列注册登录号
• 2 结果与分析
• 2.1 16S rDNA文库OTU分析
• 2.2 16S rDNA序列分析
• 2.3 α-变形菌亚群的序列特点
• 2.4 γ-变形菌亚群的序列特点
• 2.5 拟杆菌门的序列特点
• 2.6 附着微生物群落动态演替特征分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 养殖环境亚硝酸盐还原酶基因的分子多样性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 养殖环境沉积物样品的采集
• 1.2 样品总DNA提取
• 1.3 池底沉积物样品理化性状测定
• 1.4 NirS 基因片段PCR扩增
• 1.5 NirS 基因文库的建立
• 1.6 NirS 基因限制性内切片段长度多态性（RFLP）分析
• 1.7 基因测序与系统发育分析
• 1.8 数据分析
• 1.9 序列Unifrac分析
• 1.10 核酸序列注册登录号
• 2 结果与分析
• 2.1 养殖池底生物地理化学性状
• 2.2 克隆文库分析
• 2.3 NirS基因的测序结果和系统发育分析
• 2.4 序列Unifrac分析结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 总结
• 附录 1 使用试剂的配制
• 附录 2 使用的仪器设备
• 附录 3 关键实验步骤补充
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果