论文摘要
研究背景骨肉瘤(Osteosarcoma)是起源于骨骼的恶性肿瘤,好发于青少年的长骨干骺端,最多见于膝关节周围,发病率为2～3例/百万人口。其恶性程度高,局部侵袭性强,且易于发生转移。近几十年,常规骨肉瘤治疗如新辅助化疗、保肢手术都取得了很大的进展,骨肉瘤的5年生存率可达到60%～80%,但仍有病人因肿瘤复发、转移而导致治疗失败。针对骨肉瘤及其肺转移现已探索开展了免疫基因治疗、反义基因治疗、抑癌基因治疗、自杀基因靶向治疗等多种极富前景的基因治疗方法。尽管骨肉瘤的基因治疗在许多方面取得了一定的进展,甚至有些基因治疗方案显示了临床实验计划,但目前所进行的工作绝大多数尚处于实验阶段,许多关键性的技术和理论仍有待进一步深入研究。 研究目的 ①制备适合与载体EMBL3相连接的骨肉瘤基因组DNA部分酶切产物,为构建骨肉瘤的基因组文库做好前期工作;②比较提取骨肉瘤基因组DNA的几种方法,以期找到简单、快捷提取大片段基因组DNA的方法。 研究方法 ①采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,并通过测定提取的DNA的A260和A280的值和平板凝胶电泳来鉴定提取DNA的质量;②通过倍比稀释限制内切酶Sau3A Ⅰ,控制反应温度和时间来部分酶切骨肉瘤基因组DNA,再通过凝胶电泳分析获得18kb～23kb可插入EMBL3载体基因片段大量富集所需要的限制内切酶Sau3A Ⅰ的酶量,推测部分酶切基因组DNA所需要的反应条件;③采用玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒回收目的片段DNA、蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA和酚、氯仿直接抽提乙醇沉淀部分酶切产物来回收目的片段DNA。测定回收DNA的A260和A280的值,计算回收目的DNA片段的纯度和回收率,凝胶电泳分析回收DNA的片段大小以及酶切的基因组DNA是否按预计酶切进行。 结果 ①两种方法从骨肉瘤标本中提取各约800μg的基因组DNA,其A260/A280在1.8～2.0之间。提取的DNA经0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,表明:方法一提取的基因组DNA片段小于60kb且有较多的降解,方法二提取基因组