草酸盐高效降解菌的筛选及其酶学性质研究

论文摘要

草酸盐降解菌及其降解酶的研究具有很多潜在的应用价值。一方面可用于致病真菌Sclerotinia sclerotiorum所引起的重要经济作物菌核病的防治，及抗病性转基因植物的生产：另一方面，草酸盐降解酶被用于诊断和治疗与草酸盐相关的疾病，如肾结石，以及环境的生物治理。本论文分离筛选出具有较强草酸盐降解能力的新菌，并对该菌降解酶的酶学性质及降解机理进行了研究。在酸性介质中草酸能够催化重铬酸钾对次甲基蓝的氧化脱色反应，这种催化效率与草酸浓度呈正相关，据此建立了次甲基蓝-重铬酸钾体系测定草酸的方法。实验证明，在660 nm处不加草酸与加草酸的次甲基蓝-重铬酸钾体系反应后的吸光度差值△A在0～80μg／mL范围内与草酸浓度呈线性关系，线性方程为：△A=0．0984ρ草酸-0．0044，相关系数为0．9986。反应的最适条件为3．752×10-5mol／L次甲基蓝、0．12mol／L H2SO4和2×10-3mol／L K2Cr2O7。以草酸盐为唯一碳源和能源，从土壤中分离筛选获得一株能够降解草酸及其盐类的细菌，命名为OXJ-11。该菌在形态培养基形成的菌落为乳白色，圆形；革兰氏阴性染色为阴性杆菌；经电镜观察，为端生双鞭毛。接触酶阳性：不还原硝酸盐。能够在温度25℃-35℃范围内和pH6．0-10．0范围内好氧生长。根据其形态特征、生理生化特征及16SrRNA序列同源性分型，OXJ-11为Pandoraea属的一株新菌。这种菌能够合成草酸盐降解酶。OXJ-11产酶的最适发酵培养基配方为：0．5％草酸钠，0．3％酵母浸粉，0．05％MgSO4·7H2O，最适温度为30℃，pH为6．0-7．0。Pandoraea sp.OXJ-11的草酸盐降解酶为底物草酸盐诱导酶。以次甲基蓝-重铬酸钾氧化还原法测定反应体系草酸盐的减少量，建立了草酸盐降解酶的酶促反应体系。该酶为胞壁酶，超声破碎的条件为：输出功率200w-300w，超声破碎0．5s、间歇5s，破碎总时间7min。草酸盐降解酶的最适初始底物浓度为0．7mg／mL；最适反应温度为30℃；30℃下保温酶活力较稳定；酶反应的最适pH范围较宽为5．5-8．0；粗酶液在pH7．0-8．0范围内保温比较稳定；不同浓度的Fe2+和Cr3+对酶均有抑制作用；SDS对酶有很强的抑制作用；10mmol／L的Mg2+对酶有一定的激活作用；NaCl对酶活力有较大的影响，0．15mol／L NaCl可使酶活力下降约50％，浓度达到0．3mol／L时酶活力完全丧失。草酸盐降解酶的酶解产物之一为二氧化碳，当反应体系中含有阳离子时，二氧化碳会与阳离子反应生成碳酸盐。而过氧化氢不是酶反应产物。甲酸盐为酶解反应的另一产物，但由于OXJ-11菌中含有甲酸盐脱氢酶，因此，甲酸盐被进一步降解生成二氧化碳。OXJ-11菌的草酸盐降解酶所催化的反应，必须在有氧条件下才能进行。草酸和琥珀酸为草酸盐降解酶的可替换底物。ATP和ADP对草酸钠降解酶活性均有不同程度的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 草酸盐与植物
• 1.1.1 植物草酸的功能
• 1.1.2 过量草酸盐对植物的毒害作用及预防
• 1.2 草酸盐在动物饲料中的毒害作用及预防
• 1.3 草酸盐与人类健康
• 1.3.1 草酸和草酸盐是天然有毒物质
• 1.3.2 草酸盐与人类结石
• 1.4 草酸盐与微生物
• 1.4.1 草酸盐与真菌
• 1.4.2 嗜草酸盐细菌
• 1.4.3 草酸盐降解菌的生物技术应用
• 1.5 草酸盐的检测方法
• 1.5.1 比色法
• 1.5.2 高效液相色谱法
• 1.5.3 分光光度法及其利用草酸特性检测法
• 1.5.4 离子色谱法
• 1.5.5 酶法
• 1.6 草酸盐降解酶
• 1.6.1 草酸盐氧化酶
• 1.6.2 草酸盐脱羧酶
• 1.6.3 草酰辅酶A脱羧酶/甲酰辅酶A转移酶
• 1.7 本论文研究的目的、意义及内容
• 1.7.1 研究目的和意义
• 1.7.2 研究内容
• 2 草酸盐检测方法的确立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 测定方法
• 2.1.3 次甲基蓝-重铬酸钾体系的吸收光谱
• 2.1.4 反应时间对次甲基蓝-重铬酸钾体系的影响
• 2.1.5 次甲基蓝-重铬酸钾体系中各因素的反应条件优化
• 2.1.6 温度对次甲基蓝-重铬酸钾体系的影响
• 2.1.7 草酸催化反应的终止
• 2.1.8 工作曲线、准确度及检出限
• 2.1.9 干扰因素的影响
• 2.1.10 次甲基蓝-重铬酸钾体系的分析应用
• 2.1.11 次甲基蓝-重铬酸钾体系在酶活力测定中的应用
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 次甲基蓝-重铬酸钾体系的吸收光谱
• 2.2.2 反应时间对次甲基蓝-重铬酸钾体系的影响
• 2.2.3 次甲基蓝-重铬酸钾体系中各因素的反应条件优化
• 2.2.4 温度对次甲基蓝-重铬酸钾体系的影响
• 2.2.5 草酸催化反应的终止
• 2.2.6 工作曲线、准确度及检出限
• 2.2.7 干扰因素的影响
• 2.2.8 分析应用
• 2.2.9 次甲基蓝-重铬酸钾体系在酶活力测定中的应用
• 2.3 本章小结
• 3 草酸盐降解菌的筛选鉴定及发酵条件研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 培养基的配制
• 3.1.3 草酸盐降解菌的分离
• 3.1.4 细菌的形态观察
• 3.1.5 菌株的鉴定与生理生化反应
• 3.1.6 16SrRNA基因片断序列分析
• 3.1.7 系统发育树分析
• 3.1.8 不同种类碳源对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.1.9 不同碳源含量对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.1.10 不同种类氮源对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.1.11 不同氮源含量对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.1.12 温度对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.1.13 初始pH对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.1.14 接种量对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.1.15 发酵生长曲线的测定
• 3.1.16 培养时间对产酶活力的影响
• 3.1.17 菌体量的测定方法
• 3.1.18 草酸盐含量的测定方法
• 3.1.19 酶活力的测定方法
• 3.1.20 草酸离体叶片的防病实验
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 草酸盐降解菌的分离
• 3.2.2 生理生化特性
• 3.2.3 16S rRNA序列分析
• 3.2.4 不同碳源种类对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.2.5 不同碳源含量对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.2.6 不同氮源种类对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.2.7 不同氮源含量对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.2.8 温度对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.2.9 初始pH对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.2.10 不同接种量对菌体生长及产酶活力的影响
• 3.2.11 发酵生长曲线的测定
• 3.2.12 发酵时间对产酶活力的影响
• 3.2.13 油菜离体叶片的防病实验
• 3.3 本章小节
• 4 粗酶酶学性质的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 培养基的配制及接种方法
• 4.1.3 酶在细胞中位置的确定
• 4.1.4 蛋白含量的测定—考马斯亮蓝法
• 4.1.5 蛋白质标准曲线的绘制
• 4.1.6 超声破碎时间的确定
• 4.1.7 酶促反应初速度时间范围的确定
• 4.1.8 酶活力的测定方法
• 4.1.9 初始底物浓度对酶活力的影响
• 4.1.10 温度对酶活力的影响
• 4.1.11 酶的热稳定性
• 4.1.12 pH对酶活力的影响
• 4.1.13 酶的酸碱稳定性
• 4.1.14 金属离子对酶活力的影响
• 4.1.15 不同试剂对酶活力的影响
• 4.1.16 不同浓度NaCl对酶活力的影响
• 4.2 实验结果与讨论
• 4.2.1 酶在细胞中位置的确定
• 4.2.2 蛋白质标准曲线的绘制
• 4.2.3 超声破碎时间的确定
• 4.2.4 酶促反应初速度时间范围的确定
• 4.2.5 初始底物浓度对酶活力的影响
• 4.2.6 温度对酶活力的影响
• 4.2.7 酶的热稳定性
• 4.2.8 pH对酶活力的影响
• 4.2.9 酶的酸碱稳定性
• 4.2.10 金属离子对酶活力的影响
• 4.2.11 不同试剂对酶活力的影响
• 4.2.12 不同浓度NaCl对酶活力的影响
• 4.3 本章小结
• 5 酶降解机理的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 培养基的配制及接种方法
• 5.1.3 酶降解产物的测定方法
• 5.1.4 酶系组成的研究
• 5.1.5 酶解需氧情况的研究
• 5.1.6 可替换底物的研究
• 5.1.7 产物抑制
• 5.1.8 底物影响
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 酶解产物研究
• 5.2.2 酶系组成的研究
• 5.2.3 酶解需氧情况研究
• 5.2.4 可替换底物的研究
• 5.2.5 产物抑制
• 5.2.6 ATP、ADP对酶活力的影响
• 5.2.7 琥珀酸钠对酶活力的影响
• 5.3 本章小结
• 6 结论
• 1 本文实验研究总结
• 2 本论文的创新之处
• 3 工作展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢