蛋白芯片技术检测禽流感病毒抗原和抗体的研究

论文摘要

禽流感（Avian influenza, AI）由A型流感病毒（Avian influenza virus, AIV）引起,可感染多种动物的一类传染病,禽类（家禽、野禽）是其主要的易感宿主。自1878年首次在意大利暴发,目前禽流感已经在世界范围内分布,并且已经有人类感染禽流感的报道。鉴于禽流感对养殖业和公共卫生的危害,禽流感的检测与防制直接关系到养禽业的发展和公共卫生问题,因此研究快速、有效的检测方法一直备受关注。蛋白芯片（Protein microarry ）是继基因芯片之后发展起来的一种新技术,它以蛋白代替DNA作为检测目的物,比基因芯片更接近生命活动的物质层面,因此具有更加广阔的应用前景。AIV的核蛋白（Nucleoprotein,NP）具有高度保守性,在不同毒株和不同亚型之间具有交叉反应。因此以NP作为抗原可以检测A型流感病毒抗体生成情况,对流感监测具有重要作用。本实验在前人工作基础上利用禽流感NP基因真核表达的蛋白,经Ni+柱纯化和western blot鉴定后,点于醛基包被的载玻片上,并将胶体金技术与蛋白芯片技术相结合,采用胶体金间接标记的二抗与待检血清结合,通过柠檬酸法进行显色,对禽流感病毒NP抗原芯片进一步验证应用。利用制备的芯片分别检测1～15亚型AIV免疫血清和20份现地血清,其结果与HI实验符合率为100%。利用制备的NP抗原芯片检测56份野鸟免疫血清,其结果与HI检测结果符合率为94.6%。NP抗原芯片与SPF鸡血清、抗新城疫病毒（NDV）、抗传染性法氏囊病毒（IBDV）血清反应结果均为阴性,表明NP抗原芯片具有高度特异性和准确性,可以为AIV抗体检测提供新方法,并为制备检测其它病原抗体的蛋白芯片奠定工作基础。进一步开展了蛋白芯片技术检测AIV抗原的研究,初步建立一种用于鉴别禽流感病毒H5、H7、H9亚型抗体芯片的方法。本实验利用蔗糖梯度密度离心方法,分别纯化AIV的H5、H7、H9亚型病毒,免疫新西兰大白兔制备AIV兔源多克隆抗体,将制备的兔源多克隆抗体通过Protein A亲和纯化和western-blot鉴定后,得到纯化的H5、H7、H9抗体,将其作为捕获蛋白,点于醛基包被的载玻片上,制备抗体芯片。优化一系列工作参数后,点样浓度在4 mg/ml,1%BSA封闭50 min,一抗稀释度1:400,二抗稀释度为1:2000。在此条件下分别对H5、H7、H9亚型病毒进行鉴别诊断,结果表明抗体芯片检测方法对H5、H7、H9尿囊液可准确鉴别,对H5、H7的鉴别诊断与病毒分离培养和RT-PCR检测符合率为100%,但是对H9亚型检测效果不如前两者。分别对阴性尿囊液和AIV其它亚型尿囊液检测证明抗体芯片具有良好的特异性。利用稀释后的阳性尿囊液探索抗体芯片敏感性表明抗体芯片可对原倍尿囊液和10-1稀释尿囊液实现鉴别诊断,而当稀释10-2后未能呈现荧光信号,并且抗体芯片对人工感染后的喉拭子和泄殖腔拭子样品也未能呈现阳性信号。研究结果表明,利用抗体芯片检测AIV的H5、H7、H9亚型病毒具有可行性,但还有很多问题需要解决,特别是需要进一步提高其灵敏性才有可能形成完善的诊断方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 禽流感病毒概述
• 1.2 禽流感诊断方法研究进展
• 1.2.1 病毒分离培养
• 1.2.2 血清学诊断
• 1.2.3 分子生物学检测方法
• 1.3 蛋白芯片研究进展
• 1.3.1 蛋白芯片原理
• 1.3.2 蛋白芯片技术分类
• 1.3.3 待检样品的标记
• 1.3.4 蛋白芯片信号检测方法
• 1.3.5 蛋白芯片的应用
• 1.3.6 蛋白芯片存在问题与前景
• 1.4 抗体芯片研究进展
• 1.4.1 抗体来源
• 1.4.2 载体包被
• 1.4.3 抗体芯片技术应用
• 1.5 研究目的与意义
• 第二章 禽流感NP 抗原芯片应用
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与血清
• 2.1.2 实验动物及鸡胚
• 2.1.3 重组杆状病毒及细胞
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 免疫血清制备
• 2.2.2 NP 的表达纯化
• 2.2.3 NP 的SDS-PAGE和western blot分析
• 2.2.4 NP 抗原芯片制备
• 2.2.5 封闭
• 2.2.6 添加待检样品
• 2.2.7 二抗孵育
• 2.2.8 显色
• 2.2.9 结果判定
• 2.2.10 蛋白芯片特异性检测
• 2.2.11 现地血清样品检测
• 2.2.12 野鸟免疫血清样品检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 AIV免疫血清制备
• 2.3.2 NP 的 SDS-PAGE 和 western blot 分析
• 2.3.3 cutoff 值界定
• 2.3.4 蛋白芯片特异性检测结果
• 2.3.5 现地血清检测结果
• 2.3.6 野鸟免疫血清检测结果
• 2.4 讨论
• 第三章 禽流感抗体芯片检测方法的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 毒株和血清
• 3.1.2 引物设计
• 3.1.3 实验动物及鸡胚
• 3.1.4 实验主要试剂
• 3.1.5 实验主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 病毒纯化
• 3.2.2 兔源多克隆抗体制备
• 3.2.3 多克隆抗体纯化
• 3.2.4 纯化抗体的SDS-PAGE和western blot分析
• 3.2.5 禽流感抗体芯片制备与检测程序
• 3.2.6 结果判定
• 3.2.7 抗体芯片工作条件优化
• 3.2.8 抗体芯片的特异性
• 3.2.9 抗体芯片的敏感性
• 3.2.10 已知抗原鉴别检测
• 3.2.11 人工感染样品检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 病毒纯化
• 3.3.2 兔源多克隆抗体制备
• 3.3.3 多克隆抗体纯化结果
• 3.3.4 纯化抗体SDS-PAGE和western blot分析
• 3.3.5 抗体芯片条件优化结果
• 3.3.6 抗体芯片的特异性
• 3.3.7 抗体芯片的敏感性
• 3.3.8 cutoff值界定
• 3.3.9 已知抗原鉴别检测
• 3.3.10 人工感染样品检测
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历