芽孢杆菌M-21 β-甘露聚糖酶的产生、纯化与性质研究

论文摘要

β-甘露聚糖酶是一类能够水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖的生物活性酶。在食品、医药、饲料、造纸、石油等方面已得到广泛应用;近年来,它在降解植物胶生产功能性甘露低聚糖以及作为食品和饲料添加剂等方面倍受关注。本研究从土壤中分离、选育出β-甘露聚糖酶产生菌株,对其进行初步鉴定,考查了不同因素对菌株发酵产酶的影响,对酶进行了分离纯化与性质研究,并用此酶降解制备甘露低聚糖,对甘露低聚糖进行了分离纯化和结构分析鉴定。主要研究成果如下:（1）通过富集培养、分离纯化、选择性平板分离、平板水解圈初筛和摇瓶复筛,从土壤中筛选出一株具较高产β-甘露聚糖酶能力的菌株（编号为M-21）,经初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。（2）通过单因素实验和正交优化实验,确定了Bacillus sp. M-21最佳发酵产酶条件。菌株的产酶最适培养基组成包括（g/L）碳源:瓜尔豆胶4,复合氮源:豆粉20、（NH4）2HPO4 5,其他无机盐组分:K2HPO4·3H2O 1、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 0.5、CaCl2 0.1、FeSO4·7H2O 0.001。产酶最适培养条件:培养基初始pH 8.0,接种量4%,装液量50 mL/250 mL三角瓶,32℃180 r/min振荡培养36 h。此条件下酶活力最高可达1487 U/mL。（3） Bacillus sp. M-21产β-甘露聚糖酶经1.4倍丙酮沉淀、Q-sepharose阴离子交换柱后分离纯化,SDS-PAGE电泳确定酶的分子量为33.4 kDa。相比之下,此β-甘露聚糖酶的分离步骤简单,酶的比活力和回收率（70.1%）都很高,具有工业上大量制备的前提。（4）此β-甘露聚糖酶最适反应的pH为7.0,且耐受的pH范围较宽（5.0-11.0）,具有一定的耐碱性;最适反应温度为50℃,50℃以下酶活力稳定。金属离子Ba2+、Ca2+、K+、Mg2+、Na+、Mn2+对酶有不同程度的激活作用;Zn2+、Pb2+、Fe2+、Cu2+、Hg2+、Ag+有对酶有抑制作用。酶对魔芋胶、刺槐豆胶和瓜尔豆胶的Km值分别为3.97、8.79和17.56mg/mL,Vmax值分别为9.02、12.44和20.92μmol/（min·mL）。菌株M-21所分泌的β-甘露聚糖酶的最适底物为魔芋胶。（5）酶降解魔芋胶、刺槐豆胶、瓜尔豆胶制备甘露低聚糖,通过乙醇分级沉淀、凝胶过滤层析（Bio-Gel P-4 Extra Fine）对寡糖进行分离纯化,经TLC、质谱分析,魔芋胶酶解产物由二糖、三糖、四糖等一系列寡糖片段组成,单糖很少。本研究为β-甘露聚糖酶的工业化生产和甘露低聚糖的酶法制备提供了一定的理论和实践依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 0 前言
• 0.1 立题背景和意义
• 0.2 β-甘露聚糖酶的研究进展
• 0.2.1 β-甘露聚糖酶的来源及其性质
• 0.2.2 β-甘露聚糖酶的诱导表达
• 0.2.3 β-甘露聚糖酶的分类和酶活测定方法
• 0.2.4 β-甘露聚糖酶的分离纯化
• 0.2.5 β-甘露聚糖酶的应用
• 0.3 甘露低聚糖的酶法制备和应用
• 0.3.1 甘露聚糖的结构和组成
• 0.3.2 β-甘露聚糖酶的作用方式及其水解产物
• 0.3.3 酶水解甘露多糖的影响因素
• 0.3.4 甘露低聚糖的酶法制备工艺
• 0.3.5 甘露低聚糖的生理功能和应用
• 1 β-甘露聚糖酶产生菌M-21 的筛选和鉴定
• 1.1 引言
• 1.2 实验材料
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 主要仪器
• 1.2.3 培养基
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 土壤样品的采集
• 1.3.2 产酶菌株的富集培养和分离纯化
• 1.3.3 产酶菌种的初筛
• 1.3.4 产酶菌种的复筛
• 1.3.5 β-甘露聚糖酶活力的测定
• 1.3.6 菌株的初步鉴定
• 1.4 结果与讨论
• 1.4.1 标准曲线的绘制
• 1.4.2 产酶菌株的筛选
• 1.4.3 菌株的初步鉴定
• 1.5 小结
• 2 芽孢杆菌 M-21 产β-甘露聚糖酶发酵条件的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 菌种和培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 摇瓶培养条件
• 2.3.2 发酵产酶培养基的优化
• 2.3.3 发酵产酶培养条件的优化
• 2.3.4 生长曲线和产酶曲线的测定
• 2.3.5 菌体生物量的测定
• 2.3.6 酶活力测定方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 产酶最适培养基的研究
• 2.4.2 发酵产酶条件的优化
• 2.4.3 产酶时间进程
• 2.4.4 菌株M-21 的产酶性状的稳定性
• 2.5 小结
• 3 β-甘露聚糖酶的纯化和酶学性质研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 β-甘露聚糖酶粗酶液的制备
• 3.3.2 β-甘露聚糖酶活力的测定（DNS 法）
• 3.3.3 蛋白质含量的测定
• 3.3.4 酶的分离纯化方法
• 3.3.5 SDS-PAGE 鉴定酶的纯度及测定酶的分子量
• 3.3.6 酶学性质
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 硫酸铵盐析
• 3.4.2 酶的丙酮沉淀
• 3.4.3 Q-Sepharose FF 阴离子交换层析
• 3.4.4 纯化效果小结
• 3.4.5 SDS-PAGE 鉴定酶的纯度及测定酶的分子量
• 3.4.6 pH 对酶活性和酶稳定性的影响
• 3.4.7 最适温度及温度稳定性
• 3.4.8 金属离子对酶活性的影响
• 3.5 小结
• 4 甘露低聚糖的制备和分离纯化
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 原料
• 4.2.2 层析柱及填料
• 4.2.3 化学试剂
• 4.2.4 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 甘露低聚糖的制备
• 4.3.2 糖的定量测定方法
• 4.3.3 魔芋葡甘露寡糖的TLC 分析
• 4.3.4 ESI-MS 质谱分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 甘露低聚糖的乙醇分级沉淀
• 4.4.2 甘露低聚糖的凝胶过滤层析
• 4.4.3 魔芋葡甘露寡糖（KOS）的薄层色谱分析
• 4.4.4 ESI-MS 谱图解析
• 4.5 小结
• 5 研究结论和今后工作设想
• 5.1 结论
• 5.2 今后工作设想
• 参考文献
• 发表文章情况
• 致谢