高免疫活性灵芝多糖菌株的筛选及发酵条件的研究

论文摘要

本研究以总多糖和β-1,3-D-葡聚糖含量为指标,结合小鼠巨噬细胞Raw264.7活性及脾细胞增殖活性测定,对灵芝属5个种（G. lucidum, GL;G. tsugae, GT;G. oerstedii, GO;G. subamboinense, GS;G. resinaceum, GR）25个菌株中产高免疫活性多糖的菌株进行了筛选,对液体发酵条件进行了优化,并对总多糖和β-1,3-D-葡聚糖含量与免疫活性的相关性进行了分析。25个菌株在同一条件下进行液体发酵培养,水提醇沉法获取菌丝体多糖,苯酚-硫酸法测定总多糖含量,鲎G-因子法测定β-1,3-D-葡聚糖含量, Griess法、中性红法分别测定巨噬细胞NO生成和吞噬活性,MTT法分析小鼠脾细胞增殖活性。结果显示,25个菌株的多糖提取物中多糖和β-（1,3）-D-葡聚糖含量最高的分别为T1（65.96%）和S1（2.04%）,多糖产量最高的菌株为T4（0.55g/L）。所有多糖提取物均能显著提高小鼠巨噬细胞Raw264.7 NO释放、吞噬中性红能力,并均能显著促进小鼠脾细胞增殖,对ConA诱导的脾细胞过度增殖具有抑制作用。其中免疫活性最强的为S1多糖提取物。培养基渗透压研究发现,用1%PEG调节渗透压能够促进胞内多糖积累,添加0.5%NaCl和1%PEG可显著增加多糖提取物中多糖和β-（1,3）-D-葡聚糖含量。2.5%海藻糖与1% PEG可促进多糖提取物刺激NO生成,加0.5% NaCl后可显著提高多糖提取物促脾细胞增殖能力,加1% PEG后多糖提取物反而抑制脾细胞增殖,其它条件对多糖提取物促脾细胞增殖活性影响不大。摇瓶培养有利于胞内多糖积累（1.86g/L）,静置或两步培养虽不利于多糖积累,但提取物中多糖含量较摇瓶培养分别提高了1.76和1.63倍,β-（1,3）-D-葡聚糖含量分别提高了8.44和1.73倍。免疫活性实验表明,两步培养组多糖促NO生成、脾细胞增殖能力较摇瓶培养组分别提高了1.65倍、1.10倍,而对促吞噬活性影响不大;静置培养组促NO生成、吞噬活性、脾细胞增殖能力较摇瓶培养组分别提高了4.00倍、1.09倍、1.56倍。培养基中添加三萜合成前体鲨烯（0.05,0.1,0.5mL/200mL）,摇瓶培养后多糖提取物中多糖含量较对照组有了显著性降低,低浓度鲨烯组多糖中β-（1,3）-D-葡聚糖增高,但随着鲨烯量的增加,β-（1,3）-D-葡聚糖含量逐渐降低。添加0.5mL鲨烯发酵组多糖产量较对照组提高了1.76倍。体外免疫实验表明,添加鲨烯对多糖提取物免疫活性的提高没有明显的促进作用。两步培养中添加0.5mL鲨烯有助于多糖提取物中多糖、β-（1,3）-D-葡聚糖的积累,并表现出较强的促NO生成、脾细胞增殖活性。提取物中多糖和β-（1,3）-D-葡聚糖含量与免疫活性相关性分析结果表明,免疫活性与多糖含量不存在相关性,而与β-（1,3）-D-葡聚糖含量存在显著正相关性,因此可用β-（1,3）-D-葡聚糖作为评价免疫活性的化学指标。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 灵芝多糖研究进展
• 1.1 灵芝多糖的药理和保健作用
• 1.1.1 免疫调节
• 1.1.1.1 增强单核巨噬细胞与NK 细胞功能
• 1.1.1.2 增强细胞免疫功能
• 1.1.1.3 增强体液免疫功能
• 1.1.2 抗肿瘤作用
• 1.1.3 抗病毒作用
• 1.1.4 降血糖作用
• 1.1.5 清除自由基及抗衰老作用
• 1.1.6 其它作用
• 1.2 灵芝多糖的结构与其生物活性间的关系
• 1.3 生产工艺
• 1.3.1 影响灵芝多糖形成的因素
• 1.3.1.1 接种量
• 1.3.1.2 培养基的组成
• 1.3.1.3 环境因子
• 1.3.1.3.1 pH 值
• 1.3.1.3.2 发酵温度
• 1.3.1.3.3 通气与搅拌
• 1.3.2 提取分离
• 1.3.2.1 提取
• 1.3.2.2 分离纯化与结构鉴定
• 1.4 本课题研究背景、目的和意义
• 第二章材料和方法
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 发酵
• 2.2.1.1 培养基
• 2.2.1.2 菌种活化
• 2.2.1.3 种子培养
• 2.2.1.4 不同渗透压条件的液体发酵
• 2.2.1.5 两步培养方式的液体发酵
• 2.2.1.6 添加鲨烯的液体发酵
• 2.2.2 菌丝多糖的提取
• 2.2.3 多糖含量测定
• 2.2.3.1 试剂的配制
• 2.2.3.2 多糖测定标准曲线的绘制
• 2.2.3.3 不同菌丝体多糖提取物中多糖含量的测定
• 2.2.4 β-（1,3）-D-葡聚糖含量测定
• 2.2.4.1 实验器具的准备
• 2.2.4.2 试剂的配制
• 2.2.4.3 β-（1,3）-D-葡聚糖测定标准曲线的绘制
• 2.2.4.4 不同菌丝体多糖提取物中β-（1,3）-D-葡聚糖含量的测定
• 2.2.5 菌丝体多糖提取物中多糖的分子量大小及分布测定
• 2.2.5.1 色谱条件
• 2.2.5.2 分子量-保留时间标准曲线的绘制
• 2.2.5.3 菌丝体胞内多糖分子量大小及分布测定
• 2.2.6 菌丝体多糖提取物免疫活性的测定
• 2.2.6.1 样品预备
• 2.2.6.2 细胞培养
• 2.2.6.3 实验条件优化
• 2.2.6.3.1 NO 实验中Raw264.7 细胞密度的选择
• 2.2.6.3.2 NO 实验中样品浓度的选择
• 2.2.6.3.3 吞噬活性实验样品浓度的选择
• 2.2.6.3.4 脾细胞增殖实验药物浓度的选择
• 2.2.6.4 不同菌丝体多糖对Raw264.7 细胞 NO 生成和吞噬活性的影响
• 2.2.6.5 不同菌丝体多糖对小鼠脾细胞增殖的影响
• 2.3 数据处理
• 第三章 产高免疫活性多糖灵芝菌株的筛选
• 3.1 结果
• 3.1.1 多糖理化性质的研究
• 3.1.1.1 苯酚-硫酸法中多糖含量测定标准曲线
• 3.1.1.2 不同灵芝菌株液体发酵菌丝体多糖提取物中多糖含量比较
• 3.1.1.3 不同灵芝菌株液体发酵菌丝体多糖产量比较
• 3.1.1.4 鲎G 因子法中β-（1,3）-D-葡聚糖含量测定标准曲线
• 3.1.1.5 不同灵芝菌丝体多糖提取物中β-（1,3）-D-葡聚糖含量比较
• 3.1.2 免疫实验条件优化结果
• 3.1.2.1 NO 生成实验中Raw264.7 细胞最佳密度的确定
• 3.1.2.2 NO 生成实验中最佳药物浓度的确定
• 3.1.2.3 Raw264.7 细胞吞噬中性红实验中最佳药物浓度的确定
• 3.1.2.4 小鼠脾细胞增殖实验最佳药物浓度的确定
• 3.1.3 不同灵芝菌丝体多糖提取物免疫活性分析结果
• 3.1.3.1 对Raw264.7 细胞NO 生成的影响
• 3.1.3.2 对Raw264.7 细胞吞噬中性红的影响
• 3.1.3.3 对小鼠脾细胞增殖的影响
• 3.2 讨论
• 3.3 小结
• 第四章发酵条件对灵芝多糖理化性质及免疫活性影响的研究
• 4.1 结果
• 4.1.1 渗透压对菌丝体多糖理化性质及免疫活性影响
• 4.1.1.1 渗透压对菌丝体生物量的影响
• 4.1.1.2 渗透压对菌丝体多糖及β-（1,3）-D-葡聚糖含量的影响
• 4.1.1.3 渗透压对菌丝体多糖产量的影响
• 4.1.1.4 渗透压对菌丝体多糖分子量的影响
• 4.1.1.5 渗透压对菌丝体多糖提取物促NO 生成活性的影响
• 4.1.1.6 渗透压对菌丝体多糖提取物促吞噬活性的影响
• 4.1.1.7 渗透压对菌丝体多糖提取物促脾细胞增殖活性的影响
• 4.1.2 两步培养法对菌丝体多糖理化性质及免疫活性影响
• 4.1.2.1 两步培养法对菌丝体生物量及多糖的影响
• 4.1.2.2 两步培养法对菌丝体多糖分子量的影响
• 4.1.2.3 两步培养法对菌丝体多糖提取物促NO 生成活性影响
• 4.1.2.4 两步培养法对菌丝体多糖提取物促吞噬活性影响
• 4.1.2.5 两步培养法对菌丝体多糖提取物促脾细胞增殖活性影响..
• 4.1.3 鲨烯对菌丝体多糖理化性质及免疫活性影响
• 4.1.3.1 鲨烯对菌丝体生物量的影响
• 4.1.3.2 鲨烯对菌丝体多糖的影响
• 4.1.3.3 鲨烯对菌丝体多糖分子量的影响
• 4.1.3.4 鲨烯对菌丝体多糖提取物促NO 生成活性影响
• 4.1.3.5 鲨烯对菌丝体多糖提取物促吞噬活性影响
• 4.1.3.6 鲨烯对菌丝体多糖提取物促脾细胞增殖活性影响
• 4.2 讨论
• 4.3 小结
• 第五章灵芝菌丝体多糖中β-（1,3）-D-葡聚糖含量与激活小鼠免疫细胞活性关系的研究
• 5.1 结果
• 5.1.1 不同灵芝种菌丝体多糖提取物中β-（1,3）-D-葡聚糖、多糖含量与激活巨噬细胞活性的相关性分析
• 5.1.2 不同灵芝种菌丝体多糖提取物中β-（1,3）-D-葡聚糖、多糖含量与促脾细胞增殖活性相关性分析
• 5.1.3 不同发酵条件菌丝体多糖提取物中β-（1,3）-D-葡聚糖、多糖含量与激活巨噬细胞活性的相关性分析
• 5.1.4 不同发酵条件菌丝体多糖提取物中β-（1,3）-D-葡聚糖、多糖含量与与促脾细胞增殖活性相关性分析
• 5.2 讨论
• 5.3 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文