鼠疫耶尔森氏菌基因组多态性数据库及鉴定溯源系统的研究

论文摘要

鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)(以下简称鼠疫菌)是国家甲类传染病鼠疫的病原体,鼠疫的流行曾给人类带来巨大的灾难。近年来,鼠疫在非洲及亚洲地区的流行有增无减,使得WHO将鼠疫列为重新抬头的传染病。我国鼠疫菌种资源丰富,现有12块已知的鼠疫自然疫源地,占国土总面积的15%左右。大部分鼠疫自然疫源地异常活跃,每年都有动物间鼠疫流行,而且逐渐向城市逼近。鼠疫不仅严重影响着人类的健康,而且其病原也是重要的生物恐怖剂之一,对国家安全、社会和谐与经济发展构成巨大威胁。从基因组多态性角度进行全面深入研究,将有利于阐明鼠疫菌的传播进化规律,为鼠疫防控及鉴定溯源奠定基础。本研究的目的在于,利用分子生物学实验技术,对近千株分离自不同年代和全国不同疫源地的鼠疫菌进行基因组多态性分析,获得中国鼠疫菌基因组多态性的本底数据。利用这些数据:①分析鼠疫菌基因组多态性的分布规律,探索鼠疫菌适应性进化与传播的规律;②结合菌株背景资料信息,构建可作为独立的后台元件,根据需求与各种模型或前台界面结合的鼠疫菌基因组多态性数据库;③对各种基因组多态性分析方法进行比较,筛选出能够区分近缘菌株的基因多态性靶标,设计制作能够利用多态性实验结果,对鼠疫菌进行种以下快速鉴定溯源的软件系统。鼠疫菌基因组多态性实验在细菌与环境和宿主相互斗争而生存的进化过程中,突变是无处不在的,受环境压力选择和随机突变的综合作用,细菌基因组呈现出多样性。目前认为,细菌基因组多态性产生的遗传机制主要有以下几种:以特定频率产生点突变、基因组片段重排、基因水平转移和缺失、短基因重复。利用大规模测序技术获取不同菌株的全基因组序列,并进行相互比较,结果可以充分反映上述的基因组多态性。但是在对大批量菌株进行研究时,进行全基因组测序显然不现实。因此,结合实验室前期工作基础和国际上已有的研究成果,我们设计了SNP(Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)、IS(Insert Sequence,插入序列)介导的重排鉴定、DFR(Different Region,差异区段)、MLVA(Multiple Locus VNTR Analysis,多位点串联重复序列分析)和CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,间区规律聚积的短回文重复)方法,针对各种多态性产生的不同机制,考察了鼠疫菌的基因组多态性。主要手段包括PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、测序以及对测序结果的生物信息学分析。通过实验,我们获得了126株菌的45个SNP位点信息;84株菌的39个IS插入位点信息;909株菌的23个DFR位点信息;366株菌的23个MLVA位点信息以及131株菌的3个CRISPR位点信息。比较全面的得到了中国鼠疫菌基因组多态性的本底资料。根据这些实验数据,我们对各种基因组多态性分析方法的分辨率、重现性和可操作性等指标进行了比较和分析,最终确定MLVA方法最适合用于鼠疫菌的快速鉴定溯源。在鼠疫菌的CRISPR多态性研究中,除了对国内菌株进行实验外,还通过国际合作,获得了前苏联及外蒙的自然疫源地代表性菌株实验结果。研究发现在各疫源地分离株中存在不同的地区特异性间区序列,利用这些间区序列能够将来自不同疫源地的鼠疫菌区分开,为下一步在鼠疫菌中应用spoligotyping(spacer oligonucleotide typing,间区寡核苷酸分型)技术打下基础。另外,根据CRISPR位点作为进化“记录器”的特性,我们提出了鼠疫菌的进化模型以及环绕塔克拉玛干沙漠和准葛尔盆地的鼠疫菌传播主路线等合理的创新性观点。鼠疫菌基因组多态性数据库及相关软件的设计与构建通过前期实验,我们获取了大批量中国鼠疫菌基因组多态性信息。鼠疫菌基因组多态性数据库的构建使这些信息得以有序储存和高效利用。根据各类多态性信息的数据特点不同,我们选用Visual Basic 6.0和Access2003为主要工作平台,以分模块的方式进行数据库设计。构建完成的数据库目前可以容纳SNP、IS、DFR、MLVA和CRISPR共5类多态性数据信息,各类信息可以分别与菌株背景资料信息相互关联和调用。数据库可执行记录增删、排序、查询等操作,易于升级维护;兼容性好,可方便的为其他程序提供数据支持,完成鉴定、分型、溯源、进化分析等所需功能。通过多态性实验获得的结果(如SNP实验获得的核酸序列)不能直接用于数据分析,也不便于存储。手工将这些数据进行转换需要大量时间,有时甚至要超过实验本身所需时间。针对这种情况,我们编制了多种快捷易用的基因组多态性相关软件。利用这些软件,可以非常迅速的将实验结果转换为可直接进行比对、分析、入库的数据形式;还可以将实验结果与基因组多态性数据库中预存的数据进行比对,便于用户发现待测菌株与库中已有菌株的多态性差异。基因组多态性实验的结果显示MLVA是最适合用于鼠疫菌快速鉴定溯源的方法。因此,根据MLVA数据的特点设计专门算法,并以此为核心,编制了能够以构建系统发育树的形式快速、直观的实现鼠疫菌鉴定溯源的软件系统。另外,系统可以用计算SI指数的方式辅助用户对溯源结果进行判断。为保证鉴定溯源的准确性和可操作性,在软件系统中整合了标准化的实验操作指南。该系统的系统发育树构建功能还可直接、方便的用于任意数量菌株的分型、进化分析。以上数据库和软件系统在设计时,充分考虑了简单易用的原则。系统采用多数人习惯的Windows通用界面,将以前如构建系统发育树等繁琐的计算机操作极大的简化,多数功能实现了“一键化”。结论与意义①通过实验,获得了大量中国鼠疫菌的本底数据,并存储到数据库中。在疾病流行或者遭受生物袭击时,即可采用相对简单的实验手段,将得到的结果在本地机上与数据库中的资料进行综合分析,实现鼠疫菌的准确、快速鉴定和溯源,从而为生物恐怖袭击的确认和流行病学防护提供有力保障。②数据库及多态性比对等相关软件在设计时充分考虑了兼容性和可扩充性,简单改动后就可应用于其他细菌的基因多态性研究,为生物信息学在细菌性传染病的快速检测、溯源等方面的应用做出了有益探索。③通过对鼠疫菌基因多态性靶标位点的汇总整理,进一步加强对鼠疫菌型别区分的认识,完善了鼠疫基因组分型系统,对鼠疫菌的演化与传播提出了新的见解。④我们整理入库的菌株信息在分子生物学角度上包含了鼠疫基因组中目前发现的各个重要的基因多态性位点;在地理学角度上涵盖全国,跨越了具有不同地理景观、宿主环境的广大地区。这些数据信息必将有力的推动微生物生态学和进化机制的研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 前言
• 1 鼠疫耶尔森氏菌是烈性传染病——鼠疫的病原体
• 2 鼠疫菌的基因组多态性与分型
• 3 基因组多态性数据库及微生物法医学溯源
• 4 本研究的意义
• 第一部分 鼠疫菌基因组多态性实验
• 1 鼠疫菌基因组多态性靶标的选择
• 2 材料、试剂与主要仪器设备
• 3 实验操作步骤与结果处理
• 4 各类基因组多态性分析方法快速鉴定溯源能力的比较
• 5 基于 CRISPR 多态性的鼠疫菌微进化研究
• 第二部分 鼠疫菌基因组多态性数据库及相关软件的设计与构建
• 1 用户定位与需求分析
• 2 各模块的设计与实现
• 3 系统构成与运行流程
• 4 与其他软件溯源结果的比较
• 综述 CRISPRs：结构，功能与应用
• 参考文献
• 附录一 本研究所用菌株背景资料
• 附录二 MLVA 实验结果聚类图
• 附录三 程序代码与控件属性设置
• 个人简历
• 致谢