小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的分子机制研究

论文摘要

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis,所产生的杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICPs）,对靶标昆虫具有高度选择性,但对人等非靶标生物及环境友好安全在世界范围内得到广泛的应用,在害虫防治中起着巨大的作用,和其它化学杀虫剂一样,长期处于Bt选择压力之下的害虫亦会对其产生抗性。据报道已有多种昆虫对Bt毒素产生抗性,但小菜蛾Plutella xylostella仍是至今唯一在田间发现对Bt制剂产生抗性的害虫。为明确小菜蛾对Bt产生抗性的机制,对田间小菜蛾的Bt抗性治理提供一定的理论基础,本文对小菜蛾进行室内抗药性汰选、小菜蛾生物学特征观察、适合度的研究以及对小菜蛾幼虫体内类钙粘蛋白基因（Cadherin-like Protein,简称CAD）的克隆和表达,具体结果如下:1.通过两年的抗性汰选工作,抗性小菜蛾种群对Cry1Ac毒素的抗性水平从750倍提高到目前的1,500倍以上。观察了4℃处理蛹（7d）以及抗敏杂交对小菜蛾产卵量的影响, 4℃处理蛹能够显著降低小菜蛾的产卵量,从杂交实验可以看到抗性种群（Cry1AcR）、反交种群（SS♂×Cry1AcR♀）的产卵量显著低于敏感种群（SS）和正交种群（SS♀×Cry1AcR♂）的产卵量,推断低温对蛹的处理以及杂交雌虫的抗性水平可能影响小菜蛾的产卵量。2.构建小菜蛾种群生命表,比较了抗性和敏感小菜蛾种群一系列生物学参数。结果表明,与敏感种群SS相比,抗性种群Cry1AcR蛹重显著减轻,单雌产卵量显著减少,雌雄比、孵化率以及化蛹率都显著降低,同时Cry1AcR种群的内禀增长率、净增长率和内周限增长率均有所减小,抗性品系的相对适合度仅为敏感品系的0.57。小菜蛾抗性种群在生长发育和繁殖能力方面显示了显著的不利性。3.克隆了小菜蛾SS、Cry1AcR两种群的类钙粘蛋白基因,该基因cDNA的全长为5148bp,编码1716个氨基酸。对抗、敏两种群的类钙粘蛋白进行比对,其碱基相似性为98.3%、氨基酸相似性为98.8%,与敏感种群SS相比,抗性种群Cry1AcR有87个碱基、21个氨基酸不同。通过同源性分析可知,该基因与其它昆虫体内的类钙粘蛋白的同源性高。4.运用Bac-to-Bac系统进行CAD的表达,将构建的CAD重组杆状病毒以没有连接外源基因的表达载体作为对照转染Sf9细胞,然后收集转染CAD基因和空载体的细胞以及没有转染的正常细胞的蛋白。将收集的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明,仅转染CAD重组杆状病毒的细胞能够特异性表达约为190kD蛋白产物与理论预期值相符,表明CAD获得了表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 小菜蛾概况
• 1.2 小菜蛾的抗药性研究进展
• 1.2.1 小菜蛾抗药性发生现状
• 1.2.2 小菜蛾抗药性适合度研究
• 1.3 Bt毒素的研究进展
• 1.3.1 Bt毒素
• 1.3.2 Bt毒素的分类
• 1.3.3 Bt毒素的作用机理
• 1.4 昆虫对Bt抗性研究概况
• 1.4.1 昆虫对Bt的抗性现状
• 1.4.2 昆虫对Bt的抗性机制
• 1.4.3 Bt毒素受体的研究进展
• 1.5 昆虫杆状病毒表达系统的研究
• 1.5.1 昆虫杆状病毒表达系统
• 1.5.2 杆状病毒（Baculovirus）
• 1.5.3 昆虫杆状病毒表达系统的发展及其优点
• 1.5.4 昆虫杆状病表达系统的影响因素
• 1.6 研究目的和意义
• 第二章 小菜蛾的室内饲养及汰选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 供试蔬菜
• 2.1.3 供试药剂
• 2.1.4 主要仪器和材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小菜蛾的饲养
• 2.2.2 小菜蛾的室内汰选
• 2.2.3 小菜蛾的生物测定
• 2.2.4 小菜蛾抗敏互交及蛹4℃处理对产卵量的影响
• 2.2.5 小菜蛾卵的尺寸随产卵时间的变化
• 2.2.6 数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Cry1Ac毒素对小菜蛾的抗性汰选
• 2.3.2 4℃处理的蛹对产卵量的影响
• 2.3.3 抗性小菜蛾Cry1AcR与敏感小菜蛾SS杂交对产卵量的影响
• 2.3.4 小菜蛾卵的尺寸随产卵时间的变化
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 抗Bt毒素Cry1Ac小菜蛾适合度研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 仪器和材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 成虫繁殖力观察
• 3.2.2 卵期观察
• 3.2.3 幼虫历期观察
• 3.2.4 蛹期观察
• 3.2.5 成虫寿命观察
• 3.2.6 抗性和敏感小菜蛾种群的生命表组建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 小菜蛾抗性、敏感种群的生物学特性
• 3.3.2 小菜蛾抗性、敏感种群生命表
• 3.3.3 小菜蛾抗性、敏感种群生命参数和相对适合度
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 小菜蛾抗性和敏感种群类钙粘蛋白的克隆及序列分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 供试小菜蛾
• 4.1.2 载体与菌株
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 小菜蛾SS、Cry1AcR 的中肠总RNA提取
• 4.2.2 合成cDNA
• 4.2.3 小菜蛾SS、Cry1AcR的类钙粘蛋白基因（CAD） PCR
• 4.2.4 CAD DNA 的纯化回收
• 4.2.5 CAD 的连接
• 4.2.6 转化与细菌培养
• 4.2.7 提取质粒DNA
• 4.2.8 质粒DNA 的检测
• 4.2.9 测序以及CAD 序列分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 小菜蛾SS、Cry1AcR的中肠总RNA提取
• 4.3.2 合成的cDNA 的引物检测
• 4.3.3 小菜蛾SS、Cry1Ac 的CAD的PCR扩增
• 4.3.4 CAD 的质粒酶切及PCR 检测
• 4.3.5 小菜蛾CAD 序列结果分析
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 小菜蛾类钙粘蛋白的表达
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 双酶切目的质粒（pCR-XL-TOPO /CAD）和载体质粒（pFastBacHTb）
• 5.2.2 目的片段的胶回收
• 5.2.3 目的基因与表达载体的连接
• 5.2.4 将连接产物转化至TOP10
• 5.2.5 质粒DNA 的提取
• 5.2.6 双酶切及PCR 检测
• 5.2.7 转化至感受态细胞 DH10Bac
• 5.2.8 提取杆粒Bac/ CAD-pFastBacHTb
• 5.2.9 杆粒的检测
• 5.2.10 转染与蛋白表达
• 5.2.11 重组蛋白的SDS-PAGE检测
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 CAD-pFastBacHTb质粒检测
• 5.3.2 Bac/ CAD-pFastBacHTb杆粒DNA的鉴定
• 5.3.3 表达蛋白的SDS-PAGE检测
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历