论文摘要
水稻是世界上最重要的粮食作物之一,由水稻黄单胞杆菌（Xanthomonas oryzaepv.Oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害,生产实践表明控制水稻白叶枯病最经济有效的措施是培育抗病品种。目前已经鉴定出约30个白叶枯病抗性基因,其中Xa21、Xa1、Xa26、Xa27、xa5和xa13得到分离和克隆。水稻白叶枯病抗性基因Xa2对日本菌系Ⅱ具有专一抗性。在此之前,Yoshimura et al.（1994）将Xa2初步定位于水稻第四染色体,与Xa1连锁且有2-16%的重组交换率。本研究的目的是将Xa2精细定位,并对定位区域内与抗性相关的候选基因进行遗传和功能分析,主要结果如下:1.构建包含1101个单株的IR24/IRBB2 F2群体,包含2769个单株的ZZA/IRBB2 F2群体。利用ZZA/IRBB2 F2群体中136个单株组成的随机群体,构建Xa2区域遗传连锁图。利用120个Xa2区域的SSR标记进行了抗感亲本多态性鉴定,发现其中12个在IR24/IRBB2间具有多态性,20个在ZZA/IRBB2间具有多态性。利用具有多态性的SSR标记将Xa2定位在HZR970-6与HZR645-2之间,共约200kb的距离。2.对标记HZR970-6与HZR645-2之间的DNA序列进行分析,筛选含有与抗性有关保守结构（如NBS,LRR,Kinase等）的基因。经过筛选,共得到6个含有NBS—LRR结构的候选基因,成簇分布在BAC克隆OSJNBb0085C12上,按其在BAC克隆排列顺序分别命名为RGA1、RGA5、RGA6、RGA7、RGA12和RGA14。3.根据这6个基因序列分别设计跨内含子的特异引物,从接种T7147后的IR24和IRBB2叶片中提取RNA,通过RT-PCR表达分析发现RGA5在两个亲本中都表达,但RGA12仅在IRBB2中表达。将这2个基因确定为Xa2的候选基因。4.对这2个侯选基因设计引物,进行长片段扩增,得到2个候选基因的全长序列,经质粒操作连接到表达载体pCAMBIA1301S中,电击入农杆菌。经农杆菌转化,将候选基因转入感病材料台北309和牡丹江8号中,获得再生植株。在苗期对2个候选基因的转化植株进行PCR鉴定,保存阳性单株。孕穗期接种鉴定,未能发现抗病能力较转化材料有明显改变的单株。5.分别构建两个候选基因的RNAi表达载体,电击入农杆菌。经农杆菌转化,将RNAi表达载体转入抗病亲本材料IRBB2中,获得再生植株,进行遗传功能验证。