论文题目: 抗B型肉毒毒素鼠源中和抗体快速制备及其免疫学活性的初步研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 杨秀清
导师: 荫俊
关键词: 肉毒毒素,表达纯化,免疫保护,噬菌体抗体,中和作用
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 肉毒毒素是肉毒梭状杆菌产生的外毒素,属神经强毒,人类的肉毒中毒主是由A,B和E引起。是目前已知毒性最强的细菌蛋白质之一,是重要的生物战剂。本论文以定向免疫和噬菌体展示技术为平台,探索了一种快速制备及筛选鼠源抗体的技术路线,将筛选到的高亲和力抗体直接进行中和活性实验,将抗体基因克隆、高亲和力抗体富集和抗体筛选在噬菌体水平一步完成,简便快速,研究周期短。为生物毒素新型抗毒素的制备提供新的研究思路。 本研究中首先克隆了B型肉毒毒素重链C端基因,与已知序列同源性达99%。为了获得重组蛋白,构建了pET22重组质粒载体,诱导表达后未得到目的蛋白。随后构建pET32重组质粒,获得了BoNTB/Hc的融合蛋白。对引物进行改构后,最终获得了以包含体形式存在的BoNTB/Hc N端修饰蛋白,并用金属螯和层析法进行了初步纯化和鉴定。进一步对其免疫学活性进行初步研究,结果表明重链Hc免疫后的BALB/c小鼠可以在一定程度上抵抗6×103LD50 B型肉毒毒素攻击,为B 型肉毒毒素疫苗的研究奠定了基础。同时制备了卵黄检测抗体（IgY）,抗体效价达104以上。 用重组表达并纯化的BoNTB/Hc免疫小鼠,从其脾淋巴细胞中提取全套抗体可变区基因,分别构建scFv和Fab段噬菌体抗体文库,库容分别为6.72x107cfu和5.69x106cfu。以纯化的BoNTB/Hc为抗原,对抗体库进行富集筛选,并以BoNT/B为抗原进一步鉴定特异性抗体,最终获得与BoNT/B结合能力较强的scFv抗体2个,分别命名为S3和$24,VH属于VH2家族,VK分别属于VK2和VK1家族。Fab抗体1个,命名为F38,VH属于VH1家族,VK属于VK2家族。 重组抗体免疫学保护试验表明,抗B型肉毒毒素的噬菌体抗体S3对BoNT/B致死作用的保护性较强,能够在一定程度上抵抗10LD50（i.p.）的致死作用,S24次之,F38较弱。未观测到S3,S24和F38三者的明显叠加作用。挑选作用较强
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
第一部分 B型肉毒毒素重链C端基因的克隆表达与保护作用的初步研究
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 B型肉毒毒素重链C-端基因片段的克隆表达及纯化鉴定
1.3 BoNTB／Hc对小鼠免疫保护作用的初步评价
1.4 抗B型肉毒毒素重链C-端基因鸡卵黄抗体(IgY)的制备
2 结果
2.1 BoNTB／Hc片段的PCR扩增及序列测定
2.2 BoNTB／Hc天然序列在大肠杆菌中的表达
2.3 BoNTB／Hc融合蛋白在大肠杆菌中的表达及变复性研究
2.4 BoNTB／Hc N端修饰蛋白在大肠杆菌中的表达
2.5 金属螯和层析法对BoNTB／Hc蛋白的纯化及鉴定
2.6 BoNTB／Hc免疫保护作用的初步评价
2.7 抗B型肉毒毒素重链C-端基因鸡卵黄抗体(IgY)的制备
3 讨论
第二部分 鼠源抗BoNT／B抗体库的构建筛选及抗体免疫学活性的初步研究
一 鼠源抗BoNTB／Hc噬菌体展示抗体库的构建
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 大肠杆菌感受态细胞及辅助噬菌体的制备
1.3 小鼠免疫、总RNA提取及cDNA的合成
1.4 scFv基因库(scFv repertoires)的构建
1.5 Fab基因库(Fab repertoires)的构建
2 结果
2.1 总RNA的制备及cDNA的合成
2.2 scFv基因库(scFv repertoires)的构建
2.3 Fab基因库的构建
3 讨论
二 抗B型肉毒毒素噬菌体抗体的体外亲和筛选及序列分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 实验方法
2 结果
2.1 scFv噬菌体抗体库的富集筛选及序列分析
2.2 Fab噬菌体抗体库的富集筛选及序列分析
3 讨论
三 抗B型肉毒毒素鼠源抗体免疫学活性的初步研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 实验动物
1.3 BoNT／B鼠LD_(50)的测定
1.4 相关因子对小鼠试验影响的测定
1.5 抗BoNT／B鼠源抗体免疫学活性的初步研究
2 结果
2.1 BoNT／B半数致死剂量实验
2.2 相关因子对小鼠试验影响的测定
2.3 噬菌体条件下scFv抗体免疫学活性试验
2.4 重组scFv抗体免疫学活性的初步研究
3 讨论
总结
综述
参考文献
致谢
英文缩略词表
附录一 发表综述(全文)
附录二 发表论文(全文)
发布时间: 2005-09-05
参考文献
- [1].肉毒毒素与蛋白受体相互作用的分子基础及其应用的研究[D]. 史晶.中国人民解放军军事医学科学院2007
- [2].A型肉毒毒素人源性中和抗体的制备[D]. 于蕊.中国人民解放军军事医学科学院2008
相关论文
- [1].A型肉毒毒素受体和中和抗体研究[D]. 韦娜.中国人民解放军军事医学科学院2011
- [2].抗人肝癌基因工程抗体单双价嵌合Fab的构建和在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达[D]. 董红霖.第四军医大学2005
- [3].人源肝癌单链抗体的筛选与鉴定[D]. 薛国柱.第四军医大学2005
- [4].抗SARS病毒人源Fab抗体的制备研究[D]. 康晓平.中国人民解放军军事医学科学院2005
- [5].抗肝癌噬菌体单链抗体的筛选与鉴定[D]. 周旻.暨南大学2005
- [6].重组人源抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌和巴氏毕赤酵母中的表达、纯化与性质鉴定[D]. 熊盛.华南理工大学2002
- [7].基于表位预测的抗B型肉毒毒素基因工程抗体的研究[D]. 孟露露.中国人民解放军军事医学科学院2006
- [8].肉毒毒素与蛋白受体相互作用的分子基础及其应用的研究[D]. 史晶.中国人民解放军军事医学科学院2007
- [9].A型肉毒毒素人源性中和抗体的制备[D]. 于蕊.中国人民解放军军事医学科学院2008
- [10].肉毒毒素及炭疽SFV复制子核酸疫苗的研究[D]. 李娜.中国人民解放军军事医学科学院2008