几种国兰形态学及ISSR分子鉴定

论文摘要

国兰是我国的传统名花,具有悠久的栽培历史,其幽香飘逸深受人们的喜爱。近年来,由于生境的破坏以及国兰的过度开发,国兰资源流失严重；再者,由于国兰种子无胚乳、萌发困难、周期较长,导致国兰育种工作开展较少,我国国兰资源没有得到较好的保护和开发利用。本研究从长三角地区,西南等地区收集了大量野生国兰资源,调查了五种国兰的生活习性和主要病虫害,为国兰种质资源创新和品种改良奠定了基础；利用ISSR分子标记技术,从分子水平上研究了五种国兰的遗传多样性和亲缘关系,为品种鉴定和杂交育种提供了理论依据。主要研究结果如下：1、以《中国植物志》为依据,将38份国兰材料按照形态特征进行鉴定,鉴定结果包含4棵墨兰,5棵寒兰,10棵蕙兰,12棵春兰,7棵建兰。2、研究分析了Taq DNA聚合酶含量、引物、dNTPs、Mg2+浓度以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响,先用四因素三水平正交法确定Taq DNA聚合酶含量、引物、dNTPs、Mg2+浓度的最佳组合,再优化模板浓度,筛选出扩增条带清晰,多态性丰富的ISSR引物10个,建立了稳定的,可重复的五种国兰植物ISSR-PCR的最佳反应体系：在20μl的反应体系内,宜加入10×Buffer（含Mg2+） 2μ1、Taq polymerase宜加入1.2U、dNTP的最适浓度为1.0 mmol/L、ISSR引物的最适浓度是1.5μmol/L、DNA模板100ng,最后用ddH2O补齐20μl。PCR扩增程序：94℃预变性360s,之后进行40个循环,每个循环包括94℃变性70s,复性（退火）60s,退火温度根据特定引物设置,72℃延伸70s；最后于72℃延伸420s,4℃终止反应。3、本研究利用10条ISSR引物对38份国兰材料进行扩增,共获得了89条DNA条带,其中多态性DNA条带85条,多态率达到95.5%,；在10条引物中,编号为25的春兰在引物807的300bp出现了缺失条带；引物827在350bp处对编号为18的蕙兰扩增出特异性条带,在400bp处,春兰材料25出现了缺失条带,在1100bp处,编号为19的蕙兰出现了缺失条带；引物835在450bp处,对编号为34的建兰扩增出了特异性条带。初步建立了五种国兰的部分指纹图库,为国兰的品种鉴定提供分子依据。4、根据UPGMA聚类结果,38份国兰材料分为5组,包括5棵墨兰品种,5棵寒兰品种,10棵蕙兰品种,12棵春兰品种,6棵建兰品种,与形态学分类存在细微差别,但总体一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 国兰的形态特征
• 1.2 中国兰花资源分布概况
• 1.3 中国兰花种质资源研究现状
• 1.4 国兰分子标记技术应用研究概况
• 1.4.1 分子标记技术
• 1.4.2 ISSR分子标记的原理及特点
• 1.4.3 ISSR技术的反应条件
• 1.4.4 ISSR分子标记技术在植物研究中的应用
• 1.4.5 分子标记技术在国兰中的应用
• 2 研究的目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 形态学分类
• 3.2 ISSR分子标记
• 3.2.1 ISSR分子标记实验材料
• 3.2.2 五种国兰总DNA提取
• 3.2.3 ISSR-PCR最佳反应体系的确立
• 3.2.4 38个DNA样品的PCR扩增和数据分析
• 4 结果与分析
• 4.1 38份国兰材料的形态学鉴定
• 4.2 ISSR分子标记体系的建立
• 4.2.1 植物基因组DNA提取
• 4.2.2 ISSR-PCR反应体系建立
• 4.2.3 模板浓度的确定
• 4.2.4 引物筛选
• 4.2.5 最佳退火温度的筛选
• 4.3 38份国兰材料的ISSR分析
• 4.3.1 38份国兰材料的扩增图谱
• 4.3.2 UPGMA聚类分析
• 4.3.3 形态学鉴定与分子鉴定的比较分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 38种国兰遗传相似系数矩阵
• 附录2 部分国兰图片
• 攻读学位期间发表的学术论文目录