没药倍半萜化合物抑制前列腺癌细胞增殖的作用机制研究

论文摘要

前列腺癌（prostate cancer,PCa）在欧美国家的发病率居男性恶性肿瘤的第二位,在我国发病率相对较低,但近年来呈上升趋势,位于泌尿系肿瘤的第3位。前列腺癌潜伏期长,恶性程度高,死亡率高,其发病机制及生物学特性复杂。研究证实,雄激素受体（Androgen receptor AR）在前列腺癌的发生发展、恶化转移中起重要作用。AR属于核受体家族,通过介导雄激素的作用,转录激活雄激素诱导基因（androgen-inducible genes）的表达,从而影响前列腺的正常生长发育和维持前列腺的正常分泌功能。通常,AR定位在细胞胞质区,与热休克蛋白等形成多蛋白无活性的复合体。结合雄激素配体后,AR构象改变,与热休克蛋白解离、磷酸化成为活化的AR进入细胞核内,其二聚体特异识别并结合在雄激素诱导基因调控区的雄激素应答元件（androgen responsive elements,AREs）上,募集辅助调节因子（cofactors）,调节靶基因的转录。在前列腺中,上调前列腺特异抗原（prostate-specific antigen,PSA）、人激肽释放酶2（human glandularkallikrein,hk2）表达。对前列腺癌而言,激素撤除疗法是治疗晚期前列腺癌的主要方法,但患者通常在治疗一年左右后复发,前列腺癌不再对激素敏感,导致激素治疗失败、前列腺癌演变为激素非依赖性前列腺癌（hormone refractoryprostate cancers,HRPCs）。现已证实,AR的高表达、基因突变产生的有功能的突变体以及AR的非激素依赖性激活、AR辅激活因子的过表达等造成的AR功能异常活化是导致PCa发生、发展、恶化转移、多药耐药的机理之一,也是前列腺癌演变为激素非依赖性前列腺癌的分子机制,其演变过程更为复杂,给临床的早期诊断和治疗带来困难。目前,化疗是治疗HRPCs的主要手段,临床上的治疗药物各有其作用特点,但效果不佳,因此寻找高效、靶向性强的抗前列腺癌药物仍然是治疗前列腺癌亟待解决的问题。其中降低AR的表达、抑制其功能可能是很效治疗靶点之一。亚洲国家PCs的低发病率使科学家们对其饮食结构产生兴趣,研究证实,黄酮、多酚类化合物被认为是预防治疗PCs很有潜力的药物。没药（myrrh）为临床常用镇痛中药,目前从没药中已分离鉴定了300多个化合物,包括萜类、甾体、黄酮、木脂素等化学成分。最近的研究表明,没药倍半萜成分具有抗肿瘤活性,但其抗肿瘤的分子机制尚无深入研究。我们对分离得到的两个吉玛烷型倍半萜化合物（Germacrane sesquiterpenoids）,化合物1∶1（10）E,2R,4R)-2-甲氧基-8,12-环氧吉玛-1（10）,7,11-三烯-6-酮（1（10）E,2R,4 R）-2-methoxy-8,12-epoxygermacra-1（10）,7,11-trien-6-one,简称ST1),化合物2∶2-甲氧基-5-乙酰基-4-呋喃吉玛-1（10）-烯-6-酮（2-methoxy-5-acetoxy-furanogermacr-1（10）-en-6-one,简称ST2）进行了抗肿瘤活性分析,其中对前列腺癌细胞的抑瘤活性较为突出,本文就该类化合物抑制前列腺癌细胞增殖的作用机制进行了初步探讨。通过细胞增殖实验首先检测ST化合物的抑瘤活性,结果显示,ST在较高浓度时（80μmol/L）对大肠癌HT29细胞增殖有显著的抑制作用,对前列腺癌激素依赖性细胞LNCaP、激素非依赖性PC3、PC3M、DU145细胞在浓度为40μmol/L时均有明显的抑瘤活性。通过利用肝正常永生化细胞进行化合物毒性检验,结果表明ST1在浓度为80μmol/L时对正常细胞有抑制作用。进一步利用流式细胞术分析ST化合物对前列腺癌LNCaP细胞的细胞周期变化及细胞周期相关蛋白表达的影响。结果显示,两个没药倍半萜化合物使S期细胞明显减少,细胞主要停滞于G0/G1期,但没有显著的诱导凋亡作用。通过反转录PCR（RT-PCR）、蛋白印迹技术、细胞瞬时转染技术分析细胞周期主要调控因子之一p21WAF/CIP1及G0/G1期调控蛋白cyclinD的表达,结果表明,ST能在mRNA和蛋白水平诱导p21WAF/CIP1的表达,同时降低细胞周期蛋白cyclinD的表达,降低cyclinD启动子的表达活性。从结果来看,化合物对p21WAF/CIP1及cyclinD的影响并不是非常显著。由于AR在前列腺癌LNCaP细胞的增殖中处于关键位置,ST化合物是否通过影响AR的表达和功能抑制前列腺癌细胞的增殖是我们需要进一步探讨的问题。Western Blot结果显示,雄激素能非常显著的诱导AR的表达,而ST1、ST2均能在雄激素存在的情况下显著降低AR的表达、并减少AR向细胞核定位;荧光素酶活性分析表明,ST能抑制AR启动子的表达活性;细胞免疫荧光结果也证实ST化合物对AR表达的抑制作用。抑制AR功能是抑制细胞增殖的关键所在,通过检测PSA启动子表达活性、以及检测只含有hk2基因调控区中ARE元件的报告基因表达活性来研究AR的转录激活功能。结果表明,ST化合物能非常显著的抑制PSA启动子和hk2—ARE元件报告基因的表达活性;另外PSA为分泌蛋白,通过检测细胞培养液PSA的蛋白水平发现,雄激素显著增加PSA蛋白水平,而细胞经ST化合物处理后,PSA蛋白水平显著降低,表明化合物能显著抑制AR的转录激活功能。另外,AR的辅助调节因子通过与AR蛋白间的相互作用直接影响AR的转录激活功能,我们通过免疫共沉淀检测化合物对AR与AR辅助激活因子SRC-1和ARA70蛋白间相互作用的影响。结果显示,激素显著加强AR与SRC-1蛋白、ARA70蛋白问的相互作用,而倍半萜化合物明显降低这种蛋白间的相互作用。总之,本研究结果表明,我们分离得到的两个倍半萜单体化合物可以抑制前列腺癌细胞的增殖,其作用机制可能通过阻滞细胞周期、抑制AR的表达、抑制AR与辅助激活因子的相互作用,从而降低AR的功能,抑制细胞增殖。本项研究结果为没药抗肿瘤活性的研究提供了资料,也为前列腺癌的药物治疗开阔了思路。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写表
• 前言
• 一 雄激素受体与前列腺癌
• 二 前列腺癌的化疗与没药
• 实验材料和方法
• 一、实验仪器
• 二、实验材料与试剂
• 三、实验方法
• 实验结果
• 一、倍半萜化合物对肿瘤细胞增殖的影响
• 二、倍半萜化合物对前列腺癌细胞周期的影响
• 三、倍半萜化合物对细胞周期相关蛋白表达的影响
• 四、倍半萜单体化合物对AR表达和功能的影响
• 五、倍半萜单体化合物对AR与AR辅助激活因子相互作用的影响
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表