牛病毒性腹泻病毒抗原检测、流行病学研究及分离株E2基因的克隆表达

论文摘要

以抗BVDV单克隆抗体作为捕获抗体,与鸡抗BVDV IgY（检测抗体）联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品确定判定检测结果的OD490临界值。利用该方法,同时采用病毒分离和RT-PCR方法检测临床粪样23份,结果表明:该方法检测结果与病毒分离和RT-PCR方法的符合率达93.75%和83.33%。进一步优化检测体系,使其检测灵敏度达到274ng/mL;与冠状病毒及轮状病毒无交叉反应,但与猪瘟病毒存在弱交叉反应;通过引入质控血清进行质控检验,试剂盒所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求;经稳定性、重复性试验,试剂盒4℃可以保存6个月,批间和批内的变异系数分别为8.37%和4.31%。初步完成了BVDV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）检测试剂盒的标准化,为批量生产奠定了基础。利用该试剂盒,对新疆北疆6个大型集约化牛场进行BVDV感染调查,结果表明:牛场普遍存在着BVDV的感染,呈零星散发状态,看似正常的牛群也存在着一定的感染,发病牛场感染率达到100%。进一步对各牛场感染病毒进行了细胞培养特性和基因型鉴定,发现感染病毒细胞培养特性和基因型一致,均为非致细胞病变型,BVDV-1型病毒。通过系统进化分析,有两株病毒属于BVDV-1b型,1株属于BVDV-1c型,其余不属于已公布的任何亚型,初步确定属于BVDV一个新的亚型类群。应用RT-PCR方法及套式PCR克隆得到3株新疆分离株E2基因片段（shihezi148、manasi和MNS2）GenBank登录号:EU159699、EU159703和EU169937,序列分析结果表明:三株E2基因长度分别为1121bp、1122bp和1122bp,分别编码373、374和374个氨基酸残基的多肽;核酸序列同源性和系统发生分析表明,3株病毒均属于BVDV基因1型（BVDV-1）,shihezi 148株与澳大利亚Bega株亲缘关系最近,同处于BVDV-1c基因亚型群,其E2氨基酸同源性为90.11%;manasi株和MNS2株E2基因核酸序列仅有4个碱基的差别,它们与changchun 184和匈牙利VEDEVAC株亲缘关系最近,位于BVDV-1b基因亚型群,manasi和MNS2株与changchun184株E2氨基酸同源性分别高达98.66%98.93%。通过基因重组技术,将Shihezi 148株的E2基因克隆到pProEX HTa和pVAX1载体,构建得到了去除C端跨膜区的截短E2基因的原核表达载体pProEX HTa-E2和包括信号肽和全长E2蛋白的真核重组质粒pVAXl-E2；经过PCR、酶切及测序表明：pProEX HTa-E2和pVAXl-E2重组表达载体构建成功。将pProEX HTa-E2质粒转化大肠杆菌DH5、JM109和BL21并诱导表达，表达目的蛋白用SDS-PAGE检测，目的蛋白没有表达；用GenEscortTM试剂转染pVAil-E2质粒、pGFP质粒（阳性对照）、空白对照到BHK-21细胞，pGFP质粒表达检测表明，绿色荧光蛋白得到了一定的表达，间接证明目的载体转染后瞬时表达，但在pVAXl-E2质粒细胞转染后的细胞培养上清中用SDS-PAGE检测没有检测到表达的目的蛋白。对E2基因应用软件预测及序列分析，构建了含有不同抗原表位（1-118）-（144-340）-（100-300）-（1-345）的pET28a-ED1、pET28a-ED2、pET28a-ED3、pET28a-ED4四个质粒，转化大肠杆菌并诱导目的蛋白的表达，SDS-PAGE电泳检测结果显示所表达出了E2A、E2B、E2C、E2D融合蛋白相对分子量分别为18．6KDa、28．2KDa、29．2KDa、43．8KD，与预测蛋白分子量大小一致。Western blot分析结果表明，所表达的融合蛋白E2B、E2C、E2D被牛抗BVDV阳性血清识别。选择pET28a-ED4质粒，转化大肠杆菌并诱导目的蛋白的表达，并对表达产物进行了纯化。通过方阵滴定法初步建立了检测BVDV血清抗体的间接EllSA方法，对收集的约43份血清样品进行了检测，检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93．55％，证明了所表达的重组蛋白作为包被抗原检测牛病毒性腹泻病毒血清抗体是可行的，为试剂盒的标准化奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分:文献综述
• 第一章:牛病毒性腹泻病毒研究进展
• 1.BVD的临床表现和致病机理
• 1.1 持续性感染与免疫耐受
• 1.2.粘膜病与慢性型BVD
• 1.3 急性BVD
• 1.4.免疫抑制
• 1.5.血小板减少症和出血综合征
• 2.流行病学
• 3.BVDV的免疫防制
• 第二章牛病毒性腹泻病毒检测与防制技术研究进展
• 1.牛病毒性腹泻病毒检测技术
• 1.1 病毒的分离与鉴定
• 1.2 血清学检测技术
• 1.2.1 琼脂扩散试验
• 1.2.2 血清中和试验（SNT）
• 1.3 免疫学检测技术
• 1.3.1 免疫过氧化物酶（IP）技术
• 1.3.2 酶联免疫吸附试验
• 1.4 PCR检测方法
• 1.5 核酸探针检测
• 2.BVDV防制
• 第三章 牛病毒性腹泻病毒流行病学研究进展
• 第四章 牛病毒性腹泻病毒基因组结构与蛋白功能研究进展
• 1.BVDV基因组结构
• 2.BVDV的5′-UTR和3′-UTR
• 3.BVDB的大开放阅读框架
• 4.BVDV的结构蛋白
• 4.1 核心蛋白P14
• 4.2 病毒囊膜结构蛋白
• 4.2.1 囊膜蛋白gp48
• 4.2.2 囊膜蛋白gp25
• 4.2.3 囊膜蛋白gp53
• 5.BVDV非结构蛋白
• ?)'>5.1 P20(N^?)
• 5.2 P7
• 5.3 P125（NS2-3）、NS2和NS3
• 5.4 P10（NS4A）和P30（NS4B）
• 5.5 P58（NS5A）
• 5.6 P75（NS5B）
• 6.小结与展望
• 第二部分:实验研究
• 第五章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立
• 1.材料与方法
• 1.1 病毒、细胞和酶标抗体
• 1.2 实验动物
• 1.3 BVDV抗原制备
• 1.4 病毒的纯化-蔗糖密度梯度离心
• 1.5 单克隆抗体的制备与纯化
• 1.6 鸡抗BVDV IgY的制备
• 1.7 待检样品的处理
• 1.7.1 病毒细胞培养液的制备
• 1.7.2 组织样品的制备
• 1.7.3 粪样的制备
• 1.8 AC-ELISA方法的建立
• 1.9 AC-ELISA中单抗和多抗最佳工作浓度的筛选
• 1.10 AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定
• 1.11 AC-ELISA重复性试验
• 1.12 AC-ELISA在实验感染和临床BVDV样品检验中的应用
• 2.结果
• 2.1 单抗的制备与特性鉴定
• 2.2 AC-ELISA中单抗和多抗最佳浓度的筛选
• 2.3 AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定
• 2.4 AC-ELISA方法重复性试验
• 2.5 AC-ELISA在BVDV抗原检测中的临床应用
• 3.讨论
• 第六章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究
• 1.材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 样品
• 1.4 引物设计及合成
• 1.5 主要溶液配制
• 1.6 质控血清的制备
• 1.7 酶标板均一性检测
• 1.8 酶标抗体工作浓度的确定
• 1.9 抗原与单克隆抗体最佳结合浓度的确定
• 1.10 抗原与抗体IgY与最佳结合浓度的选择
• 1.11 封闭液及封闭时间的选择
• 1.12 酶标抗体作用时间的选择
• 1.13 底物显色时间的选择
• 1.14 试剂盒的组装
• 1.15 试剂盒敏感性检验及其对比试验
• 1.16 试剂盒特异性检验
• 1.16.1 阻断试验
• 1.16.2 交叉试验
• 1.17 试剂盒质量控制试验—Levey-Jennings质控图的绘制
• 1.18 试剂盒的重复性和稳定性试验
• 1.18.1 批内试验
• 1.18.2 批间试验
• 1.18.3 保存期试验
• 2.结果
• 2.1 酶标板均一性检测
• 2.2 酶标抗体工作浓度的确定
• 2.3 抗原与单抗最佳结合浓度的确定
• 2.4 抗BVDV IgY与抗原最佳结合浓度的确定
• 2.5 封闭液及封闭时间的确定
• 2.6 酶标抗体作用时间
• 2.7 底物显色时间的选择
• 2.8 试剂盒特异性检验
• 2.8.1 阻断试验
• 2.8.2 交叉试验
• 2.9 试剂盒敏感性测定
• 2.10 BVDV特异性引物RT-PCR扩增结果
• 2.11 质控血清检测结果
• 2.12 试剂盒稳定性检测
• 2.13 试剂盒保存期试验结果
• 2.14 试剂盒操作步骤
• 3.讨论
• 第七章 新疆北疆集约化奶牛场牛病毒性腹泻病毒病原学调查
• 1.材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 样品采集、处理
• 1.4 引物设计合成
• 1.5 主要溶液
• 1.5.1 消化液（EDTA-胰酶）
• 1.5.2 细胞培养液（含20%胎牛血清替代剂的RPMI-1640）
• 1.5.3 维持液（含5%胎牛血清替代剂的RPMI-1640）
• 1.6 牛病毒性腹泻病毒抗原检测
• 1.7 牛病毒性腹泻病毒阳性样品细胞培养
• 1.7.1 MDBK细胞培养
• 1.7.2 病毒接种细胞
• 1.8 牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定
• 1.8.1 病毒RNA的提取
• 1.8.2 病毒型鉴定RT-PCR
• 1.9 不同牛场牛病毒性腹泻病毒遗传进化分析
• 1.9.1 反转录体系
• 1.9.2 PCR反应体系
• 1.9.3 PCR产物的回收、连接、转化、克隆和测序
• 1.9.4 序列分析比对
• 2.结果
• 2.1 牛病毒性腹泻病毒抗原检测
• 2.2 牛病毒性腹泻病毒阳性样品基因型鉴定
• 2.3 不同牛场牛病毒性腹泻病毒遗传进化分析
• 3.分析讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 第八章 BVDV新疆分离株E2基因的克隆及序列分析
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒株
• 1.1.2 菌种和质粒
• 1.1.3 主要试剂与工具酶
• 1.1.4 引物设计与合成
• 1.1.5 培养基与抗生素
• 1.1.6 主要生化试剂与溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞毒BVDV总RNA的制备
• 1.2.2 RT-PCR扩增目的基因
• 1.2.3 RT-PCR产物的检测
• 1.2.4 DNA目的片段的回收
• 1.2.5 连接反应
• 1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.7 细菌的转化
• 1.2.8 重组质粒的小量制备
• 1.2.9 E2基因的鉴定及测序
• 1.2.10 E2基因序列分析
• 2.结果
• 2.1 RT-PCR的扩增结果
• 2.2 目的基因的重组质粒鉴定结果
• 2.3 E2基因序列测定及分析
• 2.4 E2基因的同源性分析
• 2.5 E2基因的进化分析
• 3.分析与讨论
• 3.1 BVDV新疆分离株E2基因的克隆
• 3.2 manasi、MNS分离株E2基因同CC-184株的进化关系
• 3.3 新疆分离株E2基因的抗原表位分析
• 3.4 新疆分离株E2基因的来源分析
• 第九章 BVDV新疆分离株E2基因的克隆表达
• 实验一 BVDV石河子株E2表达载体的构建及表达
• 1 材料与方法
• 1.1 毒株质粒、菌株和细胞
• 1.2 试剂
• 1.3 引物的设计及合成
• 1.4 RT-PCR
• 1.5 基因的克隆和鉴定
• 1.6 基因序列分析及潜在抗原表位比较分析
• 1.7 原核表达质粒的构建
• 1.8 真核表达质粒的构建
• 1.9 重组蛋白的诱导表达
• 2 结果
• 2.1 E2基因的克隆
• 2.2 E2基因核苷酸及氨基酸序列分析
• 2.3 潜在抗原表位比较分析
• 2.4 原核表达载体的构建与鉴定
• 2.5 真核表达载体的构建与鉴定
• 2.6 E2基因的表达及检测
• 2.6.1 E2蛋白在原核系统中的表达及检测
• 2.6.2 E2蛋白在真核系统中的表达及检测
• 3 讨论
• 实验二 BVDV玛纳斯株E2基因主要抗原表位区域的分段表达
• 1 材料与方法
• 1.1 毒株与BVDV阳性和阴性血清
• 1.2 试剂
• 1.3 引物的设计及合成
• 1.4 RT-PCR及基因的克隆和鉴定
• 1.5 序列分析及二级结构预测
• 1.6 分段表达质粒的构建
• 1.7 目的蛋白的诱导表达
• 1.8 表达产物的SDS-PAGE电泳
• 1.9 重组蛋白的Western blot检测
• 2 结果
• 2.1 RT-PCR的扩增结果与鉴定
• 2.2 序列分析
• 2.3 二级结构及抗原表位预测
• 2.4 表达重组载体的构建与鉴定
• 2.5 诱导表达SDS-PAGE电泳结果
• 2.6 Western blotting分析
• 3 讨论与结论
• 第十章:BVDV -E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立
• 1.材料与方法
• 1.1 质粒
• 1.2 试剂
• 1.3 目的蛋白的诱导表达
• 1.4 重组蛋白的特异性检测
• 1.5 重组蛋白的纯化及纯化蛋白活性检
• 1.6 重组蛋白质的包被及定量
• 1.7 间接ELISA检测方法的建立
• 2.结果
• 2.1 重组蛋白的诱导表达
• 2.2 重组蛋白的特异性检测
• 2.3 纯化后重组蛋白的SDS-PAGE及Western-blot检测
• 2.4 方阵滴定试验
• 2.5 样品检测结果
• 3.分析讨论
• 第三部分 结论
• 第四部分 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文、获奖情况
• 论文
• 获奖
• 资助项目